國立台東大學生命科學研究所碩士論文

(1)

國立台東大學生命科學研究所碩士論文

指導教授：郭曜豪教授

椆櫟柿寄生化學成分及其生物椆櫟柿寄生化學成分及其生物椆櫟柿寄生化學成分及其生物椆櫟柿寄生化學成分及其生物活性之研究

活性之研究活性之研究活性之研究

Studies on the Chemical Constituents and Biological Activities of Viscum articulatum

研究生：楊育清撰

中華民國九十七年七月

(2)

(3)

(4)

謝謝謝謝誌誌誌誌

時光荏苒，於研究所的生涯經歷了兩個寒暑，想當初為了把握僅有的時間敦促自己緩慢的實驗進度，從台東到台北來回通勤的辛苦日子，在論文順利完成的此時此刻感到一切都是值得的。

本論文得以順遂的大功告成，首先由衷感謝恩師郭曜豪教授，對學生的悉心指導與教誨，老師於天然物領域豐碩的專業知識，經常在學生遭遇問題時給予適時的提點與幫助，更感謝老師提供優越的研究環境，讓實驗的各種構想得以付諸實行，在此謹致上最誠摯的敬意與感激。

同時感謝國立東華大學暨國立海洋生物博物館宋秉鈞教授與國立台東大學廖尉岑教授對此論文的細心審核，並提供寶貴的意見，使本論文得以更臻完善。

由大學畢業進入研究所，等同於將所學做出實質的體現，有新的想法該如何表達，甚至是解決問題時的思考邏輯方式，皆是研究所生涯當中最寶貴的磨練機會，在此我要特別感謝張麗杰博士，為人親切謙和，在研究方面給予悉心的指導與幫助，並在論文起草過程中，不厭其煩的提供指正與意見，再次表達感激之意。感謝食品工業發展研究所吳明德博士，提供藥理活性測試的協助，以及在研究或生活上神來一筆的建議，著實讓人獲益良多。感謝中國醫藥大學黃慧琪博士，

在我剛接觸天然物研究領域時，給予耐心的教導。感謝國立中國醫藥研究所梁羽函小姐、輔仁大學生命科學系郭育綺教授，在藥理測試上

(5)

的協助與指導。感謝國立中國醫藥研究所董明兆博士、丁怡慧小姐及國立台灣大學孫姝雲小姐代測質譜。

感謝國立中國醫藥研究所提供良好的硬體設施與實驗儀器，使本實驗得以順利完成。從大學到碩士班畢業，前後在中醫所待了四個年頭，承蒙實驗室學長姐及夥伴們的提攜與照顧，才有苦盡甘來的這一天，特別感謝師母楊麗明老師、經常一起討論並給予建議的肇麟學長、

熱心助人的雅雯(小豆)學姊、很厲害的家慶(小黑)學長、天天一起吃飯聊天的祐任學長、平易近人的羽函、愛搞笑的雅婷、實力堅強的萍君、

碎碎唸的逸辰、泡芙好好吃的昭榮、龍雲、力川，各位無論在生活或實驗上所給予的幫助與包容，小弟謹記在心，與你們共事是我的榮幸。

此外，感謝台東大學生科所同窗揆廷、慶將、俊偉、淳信、于鈊、佩珊、婉瑜，有你們的陪伴，讓我在台東的那一年格外的充實。還要感謝陪我ㄧ路走來的嘉慧，在遭遇困難及挫折時所給予的支持與鼓勵，

讓我有繼續奮戰的勇氣。

最後要感謝我摯愛的父親與母親，從小到大無微不至的關愛與照顧，才有如今身心健康的我，你們無怨無悔的栽培與付出，才是這本論文完成的最大動力，僅此獻上最深的感激之意。

(6)

椆櫟柿寄生化學成分及其生物活性之研究椆櫟柿寄生化學成分及其生物活性之研究椆櫟柿寄生化學成分及其生物活性之研究椆櫟柿寄生化學成分及其生物活性之研究

楊育清楊育清楊育清楊育清

國立台東大學生命科學研究所

中文摘要中文摘要中文摘要中文摘要

椆櫟柿寄生(Viscum articulatum)為桑寄生科，槲寄生屬植物，其在

傳統中藥應用方面，具有治療出血、胸膜炎、痛風、心臟病、關節炎及高血壓等發炎疾病的功效。本研究以生物活性為導向進行椆櫟柿寄生生物活性成分之分離，由乙酸乙酯層分離共得到十二個化合物，經各種光譜及物理數據分析鑑定其結構，其中包括八個 flavanone 化合 物，分別為 visartiside A (1)、visartiside B (2)、naringenin-7-O-[5-O-trans- cinnamoyl-β-D-apiosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside (3)、pinocembrin-7-O- [cinnamoyl(1→5)-β-D-apiosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside (4) 、 pino- cembrin-7-O-β-D-glucopyranoside (5) 、 naringenin-7-O-β-D-glucopyran- oside (6) 、 eriodictyol-7-O-β-D-glucopyranoside (7) 、 homoeriodictyol- 7-O-glucopyranoside (8) 以及兩個 1,3-diphenylpropane 化合物 viscolin- 4^’’-O-β-D-glucopyranoside (9)、viscolin-4^’-O-β-D-glucopyranoside (10) 和 一個 benzenoid glycoside 化合物 5-O-trans-cinnamoyl-β-D-apiosyl(1→3)- α-D-glucopyranoside (11)，還有一個 triterpenoid 化合物，oleanolic acid (12)，1～3 及 9～11 為新化合物。在清除 DPPH 能力的活性試驗結果 顯示化合物 1、2、7 皆有 90%以上的高清除率，其 ED50分別為 21.76、

19.81、16.13 µg/mL。抑制 LPS 誘發 RAW 264.7 巨噬細胞產生一氧化

(7)

氮的抗發炎活性試驗，結果顯示化合物 1、2、8 在 20 µg/mL 的濃度下，

對一氧化氮產生的抑制率達 70%以上，且由 MTT 實驗結果顯示這些化合物對 RAW 264.7 巨噬細胞均無明顯的細胞毒殺活性。抑制 HSV-1 病 毒複製之抗病毒活性結果顯示，1、2 在 100 µM 時分別具有 44.04 及 37.92 %的抑制率。

關鍵字：椆櫟柿寄生、flavanone、抗發炎、抗氧化、抗病毒

(8)

Studies on the chemical constituents and biological activities of Viscum articulatum

Yu-Chin Yang

Viscum articulatum belonging to Loranthaceae family is traditionally

used to treat lots of inflammatory disease such as hemorrhage, pleurisy, gout, heart disease, arthritis and hypertension. Using bioassay-directed fractionation from the ethyl acetate layer of EtOH extract of V. articulatum, twelve compounds including eight flavanones, visartiside A (1), visartiside B (2), naringenin-7-O-[5-O-trans-cinnamoyl-β-D-apiosyl(1→2)]-β-D- glucopyranoside (3), pinocembrin-7-O-[cinnamoyl(1→5)-β-D-apiosyl (1→2)]-β-D-glucopyranoside (4), pinocembrin-7-O-β-D-glucopyranoside (5), naringenin-7-O-β-D-glucopyranoside (6), eriodictyol-7-O-β-D-gluco pyranoside (7), homoeriodictyol-7-O-glucopyranoside (8), two 1,3-di- phenylpropanes, viscolin-4^’’-O-β-D-glucopyranoside (9), viscolin-4^’-O-β- D-glucopyranoside (10) and one benzenoid glycoside, 5-O-trans- cinnamoyl-β-D-apiosyl(1→3)-α-D-glucopyranoside (11), and one triterpenoid, oleanolic acid (12) were yielded, and 1-3, 9-11 were new compounds. Structural elucidation of these isolates were based on spectroscopic analysis, especially, 1D and 2D NMR techniques for the new compounds. Compounds 1, 2 and 7 showed strong antioxidant activity by DPPH radical scavenging with ED50 at 21.76, 19.81, 16.13 µg/mL, respectively. In the anti-inflammatory experiment, compounds 1, 2 and 8

(9)

exhibited the potent inhibitory (＞70% inhibition in 20 µg/mL) effects on nitric oxide (NO) production by RAW264.7 macrophages in response to lipopolysaccharide (LPS), and they have no cytotoxic activity by MTT assay in RAW264.7 macrophages. Compound 1 and 2 also showed anti-virus activity on HSV-1 replication with 44.04、37.92 % inhibitory activity at 100 µM, respectively.

Keywords : Viscum articulatum, flavonone, anti-inflammatory, antioxidant, anti-virus.

(10)

圖目錄

頁次

圖 1-1、椆櫟柿寄生之植物型態外觀...4

圖 1-2、巨噬細胞受抗原刺激產生活性氧屬物質之過程...9

圖 1-3、槲寄生(Viscum)屬植物化合物之化學結構...15

圖 2-1、椆櫟柿寄生之化學成分萃取與分離流程(一)...31

圖 2-2、椆櫟柿寄生之化學成分萃取與分離流程(二)...32

圖 2-3、椆櫟柿寄生分離出之化合物...33

圖 3-1、Compound 1 之 HMBC、COSY 關聯圖………...….38

圖 3-2、Compound 1 之¹H NMR 光譜………..….….…...…43

圖 3-3、Compound 1 之¹³C NMR 光譜...43

圖 3-4、Compound 1 之 HMQC 光譜...44

圖 3-5、Compound 1 之 HMBC 光譜...44

圖 3-6、Compound 1 之 COSY 圖譜...45

圖 3-7、Compound 1 之 DEPT 圖譜...45

圖 3-8、Compound 1 之 IR 圖譜...46

圖 3-9、Compound 1 之 HRESIMS 圖譜...46

圖 3-10、Compound 2 之 HMBC、COSY 關聯圖...49

圖 3-11、Compound 2 之¹H NMR 光譜...52

圖 3-14、Compound 2 之 HMBC 光譜………...53

(13)

圖 3-15、Compound 2 之 COSY 光譜………..54

圖 3-16、Compound 2 之 DEPT 光譜………...…...54

圖 3-35、Compound 4 之 ESIMS 圖譜...75

(14)

圖 3-46、Compound 8 之¹³C NMR 光譜... 94

(15)

圖 3-64、Compound 10 之 IR 圖譜...112

圖 3-73、Compound 11 之 IR 圖譜...120

圖 3-77、Compound 12 之 HMQC 圖譜...125

圖 3-78、Compound 12 之 HMBC 圖譜...125

(16)

圖 4-1、1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH 之化學結構式...128

圖 4-2、Quercetin 之化學結構...134

圖 4-3、化合物 1～8 及 12 抗發炎及細胞存活率實驗結果...135

圖 4-4、化合物 9、10 抗發炎及細胞存活率實驗結果...136

(17)

表目錄

頁次

表 1、槲寄生(

Viscum

)屬植物之化學成分文獻回...11

表 3-1、化合物 1 之¹H、¹³C 光譜數據整理………....…41

表 3-2、化合物 2 之¹H、¹³C 光譜數據整理………50

表 3-3、化合物 3 之¹H、¹³C 光譜數據整理………..…..60

表 3-4、化合物 4 之¹H、¹³C 光譜數據整理………..……..70

表 3-5、化合物 5 之¹H、¹³C 光譜數據整理………..………..78

表 3-6、化合物 6 之¹H、¹³C 光譜數據整理………..………..83

表 3-7、化合物 7 之¹H、¹³C 光譜數據整理……….……..…….88

表 3-8、化合物 8 之¹H、¹³C 光譜數據整理………..…...…….93

表 3-9、化合物 9 之¹H、¹³C 光譜數據整理……….……...….100

表 3-10、化合物 10 之¹H、¹³C 光譜數據整理………….…...…….108

表 3-11、化合物 11 之¹H、¹³C 光譜數據整理……….……...116

表 3-12、化合物 12 之¹H、¹³C 光譜數據整理……….…..….123

表 4-1：清除自由基之抗氧化實驗結果...130

表 4-2：化合物 1、2、7、9、10 與 α-tocopherol 之 ED50比較表...130

表 4-3：抗發炎及細胞存活率實驗結果...134

表 4-4：粗萃取物抑制 HSV-1 複製之抗病毒實驗結果...139

表 4-5：純化合物抑制 HSV-1 複製之抗病毒實驗結果...139

表 4-6：細胞毒殺實驗結果...143

附錄：New Compounds 之UV光譜...157

(18)

縮寫表縮寫表縮寫表縮寫表

δ Chemical shift (ppm) COSY Correlated spectroscopy

DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO Dimethyl sulfoxide

ESI-MS Electrospray ionization-mass spectrometry ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HMQC Heteronuclear multiple quantum coherence HPLC High performance liquid chromatography

Hz Hertz

IR Infrared

UV Ultraviolet

NMR Nuclear magnetic resonance

MS Mass spectrum

LPS Lipopolysaccharide

DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl HSV-1 Herpes simplex virus type 1

MTT 3-4,5-Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

PBS Phosphate-buffered saline

(19)

第一章第一章第一章

第一章、、、緒論、緒論緒論緒論

第一節第一節第一節

第一節研究研究研究研究背景與背景與背景與背景與目的目的目的目的

隨著醫學科技高度發展，人類平均壽命大幅提高，伴隨年齡增長而來的老化問題日益嚴重，如惡性腫瘤、心血管疾病、高血壓、糖尿病等慢性疾病，逐漸為世人所重視；但慢性疾病發生時間較長且成因複雜，目前醫學治療尚未足以達到「治癒」的能力，主要是針對各種症狀予以舒緩，藉以延長生命及降低疾病所造成的傷害。因此，在探討造成這些疾病成因的同時，積極尋找對各種慢性疾病更具療效的藥物實為當務之急。

隨著社會發展，醫療及環保意識的抬頭，大眾越來越關注化學藥物給自身健康及環境帶來的負面影響，因此近年來由動、植物及微生物萃取二次代謝物進行疾病治療、抗蟲害、抗菌等天然藥物研究，受 到各界矚目。1960年代，科學界首度由太平洋紫杉(Taxus brevifolia)樹 皮中分離出paclitaxel (Taxol)¹，並發展為現今主要的卵巢癌、乳癌治療藥物，並帶來龐大商機，即為天然藥物研究相當成功的先例。此外，

天然藥物在應用方面已有上千年的歷史，記載於各種醫藥古籍與現代報導的藥用植物及其醫療用途，提供研究學者有力的參考價值及研究方向，配合現代化的研究報告以及不斷進步的生物活性篩選機制與化學成分分離技術，由天然物中尋找具有開發價值的藥物以治療疾病，

已逐漸成為目前新藥開發的趨勢之ㄧ。

(20)

桑寄生科槲寄生屬植物於傳統中國醫療的應用，主要治療關節炎、高血壓、心臟病等發炎相關疾病²。近年來，以槲寄生屬植物進行 抗發炎及抗氧化之研究報告屢見不鮮；檞寄生(Viscum coloratum)分離 純化得到的diphenylpropanoid化合物viscolin，在fMLP誘導人類嗜中性白血球釋放超氧陰離子的發炎模式中，展現優越的抑制活性²，進一步的研究發現，其藥理作用機轉為透過PKA/cAMP-dependent pathway改變細胞內鈣離子濃度，而抑制超氧陰離子的釋放，達到抗發炎的效果³。 檞寄生(Viscum coloratum)亦分離出darylheptanoid化合物mistletonone及 一些flavanone glycoside化合物，具有清除自由基的抗氧化能力^4,5。除了 抗發炎及抗氧化活性之外，槲寄生(Viscum album)所分離出的的槲寄生 凝集素(mistletoe lectin)可誘發HL-60和U937白血病細胞株的細胞凋亡 (apoptosis)^6,7。

本實驗室透過清除 DPPH 自由基的活性篩選後發現，椆櫟柿寄生 (Viscum articulatum)具有良好的抗氧化能力，且於文獻中記載，其生物 活性成份具有抑制嗜中性白血球產生超氧陰離子的抗發炎活性⁸，因此本實驗將以椆櫟柿寄生為題材，透過生物活性導向的分離萃取方式，

以核磁共振(NMR)及其他光譜解析鑑定其化合物之結構，並進行抗發炎、抗氧化及其他生物活性之探討，期許能發現椆櫟柿寄生所含有的生物活性成分，甚至新的化合物。

(21)

第二節第二節第二節

第二節椆櫟柿寄生之簡介椆櫟柿寄生之簡介椆櫟柿寄生之簡介椆櫟柿寄生之簡介

椆櫟柿寄生(Viscum articulatum)，別名有：風香寄生、蝦蚶草、百 子痰梗、楓寄生、赤柯寄生（台灣）、扁枝寄生（西藏）、柿寄生（雲南）、螃蟹夾、栗寄生（四川）和扁枝槲寄生等，為半寄生性灌木，利用特化的根深入寄主的組織中，藉以吸取養分，但仍具有退化的鱗片葉可行光合作用⁸。

其分類地位屬於⁹

植物界（Plantae）

木蘭植物門（Magnoliophyta）

木蘭綱（Magnoliopsida）

檀香目（Santalales）

桑寄生科（Loranthaceae）

槲寄生屬（Viscum）

椆櫟柿寄生 V. articulatum

【分佈】⁹

椆櫟柿寄生主要分布於東南亞的中國南部及西部、菲律賓、台灣、

澳洲等。本種廣泛分布於全島，從低海拔至高海拔均有。通常寄生於：

楓香、鳥心石、香楠、大葉楠、槲樹、栓皮櫟、青剛櫟、森式櫟、合歡和紅皮等。

(22)

【型態】¹⁰

寄生性小灌木。高 30~60 cm。莖基部圓柱形，灰褐色，具 2 稜，常 2~3 叉狀分枝，小枝扁平，綠色，枝節呈矩圓狀倒披針形或扁條形，上寬下狹，兩端稍縮小，兩面均具多條縱紋。葉退化成鱗片狀。花單生，

雌雄同株，著生每節頂端之節部，每簇 3 朵，中間為雌花，兩側為雄花，基部具 2 枚合生小苞片。雄花小，花被 4 片，雄蕊 4 枚，無花絲，

花葯多室，著生花被上。雌花花被 4 片，被片三角形。子房下位，花柱短，圓錐形。漿果近卵形或橢圓形，長 6~8 mm，徑 4~5 mm，熟時黃色，苞片宿存。花期 4~5 月。果期 6~8 月。

圖 1-1、椆櫟柿寄生之植物型態外觀

(23)

【效用】¹¹

全草有祛風去濕，活血舒筋，祛痰鎮咳之效。治腰肢酸痛，關節疼痛，風濕骨痛，赤白痢疾，產後血氣痛，崩漏帶下，胎動，乳少，

咳嗽多痰，小兒驚風，高血壓，癩風爛瘡，癱瘓和疥癬等。

【方例】¹¹

（1）治產後血氣痛：螃蟹夾，醪槽炖服。（四川）

（2）治婦人白帶：螃蟹夾、百節藕、天冬、蘭草根、白芨煎水。炖豬心肺服。（四川）

（3）治小兒牙疳：扁枝槲寄生全株研末吹入患處。（雲南）

（4）治牛皮癬：扁枝槲寄生研末，用雞蛋油調均擦患處。（雲南）

【化學成分與藥理活性】^8,11,12

椆櫟柿寄生全草所含的主要成分包括：齊墩果酸（oleanolic acid）、齊墩果酸酯、白樺脂酸（betulinic acid）、白樺脂醇（betulin）等三萜類

（terpenoids）化合物，以及 pinocembrin、naringenin、eriodictyol 等類黃酮（flavanoids）化合物，還有苯類（benzenoids）化合物及肌醇（inositol）

等。其中，齊墩果酸（Oleanolic acid）具有抗發炎活性，可抑制 fMLP

（formyl-L-methionyl-L- leucyl-L-phenyl-alanine）所誘導的人類嗜中性白血球產生超氧陰離子。

(24)

第第第

第三三三三節節節節抗發炎與抗氧化抗發炎與抗氧化抗發炎與抗氧化抗發炎與抗氧化之簡介之簡介之簡介之簡介

一、巨噬細胞及其功能

當身體受到外來抗原的刺激會活化巨噬細胞（macrophage）進行吞噬作用，並產生一氧化氮（nitric oxide, NO）、超氧陰離子（superoxide anion）、過氧化氫等自由基，又稱為活性氧屬物質（Reactive Oxygen Species, ROS）¹³（圖 1-2），可直接對入侵之微生物進行毒殺作用¹⁴，同時受刺激之巨噬細胞會產生前列腺素（prostaglandins）、白三烯素

（leukotriene）與血小板活性因子（platelet activating factor, PAF）等脂質發炎性傳遞物質，皆是經由酵素路徑分解細胞膜磷脂質而由巨噬細胞快速產生。其作用都是巨噬細胞對病原體發生反應後由巨噬細胞所合成及分泌之細胞激素與趨化激素所引發 ¹⁵。但因為先天性免疫反應不具專一性，在攻擊外來抗原的同時也會對自身細胞造成損害，攻擊脂質、蛋白質、醣類以及 DNA 等分子³。

二、發炎反應之徵狀

發炎反應在感染部位會有疼痛、發紅、發熱及腫脹等特徵產生，

在局部血管會反映出三種變化。第一，增加血管的直徑，導致局部血流增加，因此會發熱與發紅以及降低血流速度，血壓降低。第二種變化是血管內皮細胞（endothelial cells）被活化而表現出黏附分子以促進循環中白血球的附著。血流速度降低加上黏附分子的誘發可讓白血球附著在內皮細胞並遷移到受傷組織，此種過程稱為溢血

(25)

（extravasation）。這些改變都是由活化的巨噬細胞所產生的細胞激素引發。發炎反應一但發生，最先到達感染部位的細胞通常都是嗜中性白血球。其次是單核球，它有別於組織中的的巨噬細胞。於發炎的後期，

其他白血球如嗜酸性白血球（eosinophil）與淋巴細胞也會進入感染部位。第三種主要的變化是局部血管的通透性增加，這是因為血管壁的內皮細胞分離，導致液體與蛋白質由血管流出，聚積在局部組織，造成水腫（edema），以及疼痛¹⁵。

三、一氧化氮於發炎反應中所扮演的角色

於哺乳類動物中，L-arginine 可經由 nitric oxide synthase (NOS)催化生成 L-citrulline 及 NO ¹⁶。一氧化氮(NO)為自由基的一種，且半衰期短¹⁷，分子量小 (30 Da)，因此可作為生化訊息之傳遞物質，已知可調控多種生理機能。

一氧化氮身為二級訊息傳遞者，可促進血管擴張導致血管壁間隙擴大，提高免疫細胞進入受損傷組織的速度 ¹⁶。但遭受蜜蜂螫咬後患部紅腫脹痛，即為蜜蜂蜂毒—毒蛋白所誘發的發炎反應；若被多隻蜜蜂螫咬會導致嚴重發炎反應，血液內一氧化氮含量提高使血管過度擴張，免疫反應失控甚而引發過敏性休克導致死亡，目前治療藥物僅有腎上腺素效果較佳。近年研究發現白藜蘆醇（ trans-3,4’,5-tri- hydroxystibene, resveratrol）具有高度抗氧化及抗發炎能力¹⁸，而其保護血管和抗發炎之活性，分別與抗氧化的能力有關¹⁹。

(26)

四、抗氧化藥物之發展

近年來，醫學界研究發現移除自由基之抗氧化能力可使細胞汰換速率降低，延長細胞存活時間，有效的延緩老化現象，進而提升自體免疫能力以預防或治療惡性腫瘤等慢性疾病的發生。因此人們對於所謂的「抗氧化物質」產生極大的興趣和盼望，積極尋找類似維生素 C、

E、β-葫蘿蔔素、超氧歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）等抗氧化物質。而已知的天然抗氧化劑，如：類黃酮（flavonoids）、類胡蘿蔔素

（carotenoids）、生物鹼（alkaloids）、抗壞血酸（ascorbic acid）、維生素、酚類衍生物（phenolic derivatives）、單寧類化合物（tannin）等，

也都具有抗氧化的能力 ²⁰。目前，常被使用的天然抗氧化劑如生育醇

（α-tocopherol）、丁羥甲醚（butylated hydroxyanisole, BHA）與丁羥甲苯（butylated hydroxytoluene, BHT）等，不過生育醇價格昂貴，且抗氧化性較合成之抗氧化劑 BHA 與 BHT 差，但合成之抗氧化劑又具安全上之問題，如肝臟損害與致癌性 ²¹，因此研發價格低廉且效果顯著的天然抗氧化劑為科學界共同努力的目標。

(27)

圖 1-2、巨噬細胞受抗原刺激產生活性氧屬物質（ROS）之過程¹³。

(28)

第四節第四節第四節

第四節槲寄生屬植物槲寄生屬植物之槲寄生屬植物槲寄生屬植物之之之化學成分化學成分化學成分化學成分文獻回顧文獻回顧文獻回顧文獻回顧

本實驗將探討椆櫟柿寄生之化學成分及其生物活性，為了瞭解槲寄生屬（viscum）植物所分離出的化合物類型及結構，因此將其文獻報導蒐集整理如表 1 所示，以作為往後結構解析及生物活性試驗之參考。本屬植物已知的化合物，主要為：Aromatics、Amino acids、

Catechines、Chromones、Flavonoids、Steroids、Triterpenoids 等不同類型的骨架。

(29)

表 1：槲寄生(Viscum)屬植物之化學成分文獻回顧

Compound 化合物名稱化合物名稱化合物名稱化合物名稱 Source 基源基源基源基源

Aromatics

(3,5-Dihydroxy-phenyl)-β-D-glucopyranoside (1) V. rotundifolium²² 4-β-D-Glucopyranosyloxy-3-hydroxy-benzoic acid (2) V. articulatum⁸

4-Hydroxy-benzaldehyde (3) V. articulatum⁸

Vanillin (4) V. articulatum⁸

Methylparaben (5) V. articulatum⁸

Acetovanillone (6) V. coloratum²

Methyl cinnamate (7) V. articulatum⁸

Syringaldehyde (8) V. coloratum²

4-Hydroxy-benzoic acid (9) V. articulatum⁸

Ferulic acid (10) V. coloratum²

Protocatechuic acid (11) V. articulatum⁸

p-Coumaric acid (12) V. coloratum²

Phenaethylalkohol (13) V. articulatum⁸

3-[3-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-acryloyloxy]-1,4,5-trihydroxy -cyclohexanecarboxylic acid (14)

V. album L.²³

Gallic acid (15) V. album L.²³

Caffeic acid (16) V. coloratum²

O⁴-Cinnamoyl-chinasaeure (17) V. articulatum⁸

Coniferin 2’-O-β-D-apiofuranoside (18) V. album L.²⁴

Syringin (19) V. album L.²⁵

Methyl 3-O-feruloylquinate (20) V. coloratum²

Hirsutanone (21) V. cruciatum²⁶

Syringin (22) V. ainiformosanae²⁷

2’,3’,4’,3”-Tetramethoxy-1,3-diphenylpropane 5’,4”-di-O- β-D-glucopyranoside (23)

V. angulatum²⁸

Viscolin (24) V. coloratum²

Mistletonone (25) V. coloratum⁴

Amino acids

Thymine (26) V. coloratum²

Glycine (27) V. album var. mali L²⁹

Alanine (28) V. album var. mali L.²⁹

Leucine (29) V. album var. mali L.²⁹

(30)

表 1-1：槲寄生(Viscum)屬植物之化學成分文獻回顧(續)

Methionine (30) V. album var. mali L.²⁹

Aspartic acid (31) V. album var. mali L.²⁹

Threonine (32) V. album var. mali L.²⁹

Lysine (33) V. album var. mali L.²⁹

Serine (34) V. album var. mali L.²⁹

Isoleucin (35) V. album var. mali L.²⁹

Glutamic acid (36) V. album var. mali L.²⁹

Cysteic acid (37) V. album var. mali L.²⁹

L-Phenylalanine (38) V. album³⁰

Catechins

(2R)-2r-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-chrome-3t,5,7-triol (39) V. rotundifolium²² 5,7,3’,4’-Tetrahydroxyflavan-5-O-β-D-Xyloside(40) V. tuberculatum³¹ 5,7,3’,4’-Tetrahydroxyflavan-5-O-(2”-p-hydroxy

benzoyl)-β-D-Xyloside (41)

V. tuberculatum³¹

5,7,3’,4’-Tetrahydroxyflavan-5-O-(2”caffeoyl)-β-D-xylo- side (42)

V. tuberculatum³¹

Chromones

5,7-Dihydroxy-chromen-4-one (43) V. coloratum²

5-Hydroxychromone-7-O-glucoside (44) V. coloratum²

Flavonoids

(2S)-Naringenin-7-O-glucoside (45) V. coloratum⁵

(2S)-Pinocembrin (46) V. coloratum²

(2S)-Naringenin (47) V. coloratum²

(2S)-Eriodictyol (48) V. coloratum²

Homoeriodictyol (49) V. articulatum⁸

2’-Hydroxy-4’,6’-dimethoxychalcone-4-O- glucosdie (50)

V. album L.²⁵

Rhamnazin-3,4’-di-O-glucoside (51) V. album L.³² (2R)-5,7-Dimethoxyflavanone-4’-O-glucoside (52) V. album L.²⁵ 2’-Hydroxy-3,4’,6’-trimethoxychalcone-4-O-

glucoside(53)

V. album L.²⁵

(2S)-Homoeriodictyol-7-O-glucoside (54) V. coloratum³³ (2S)-3’,5,7-Trimethoxyflavanone-4’-O-glucoside(55) V. album L.²⁵

(31)

Compound 化合物名稱化合物名稱化合物名稱化合物名稱 Source 基源基源基源基源 2’-Hydroxy-4’,6’-dimethoxychalcone-4-O-[apiosyl(1→2)]

glucoside (56)

V. album L.²⁵

Isorhamnetin-3-O-[apiosyl(1→6)] glucosyl-7-O- rhamno- side (57)

V. album L.²⁴

Eriodictyol-7-O-β-D-glucopyranoside (58) V. articulatum⁸ (2S)-5-Hydroxy-7,3’-dimethoxyflavanone-4’-O-β-[apiosyl

(1→2)] glucoside (59)

V. ainiformosanae²⁷

Homoflavoyadorinin B (60) V. ainiformosanae²⁷

(2S)-Pinocembrin-7-O-glucoside (61) V. articulatum⁸ Pinocembrin-7-O-[apiosyl(1→5) apiosyl(1→2)]-β-D

-glucopyranoside (62)

V. angulatum²⁸

Rhamnocitrin 3-O-apiosyl(1→5)apiosyl(1→2)-[α -L- rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside (63)

V. angulatum²⁸

(2S)-Pinocembrin-7-O-[apiosyl(1→2)]-glucoside (64) V. articulatum⁸ (2S)-Pinocembrin 7-O-[cinnamoyl(1→5)-β-D-apiosyl

(1→2)]-β-D-glucoside (65)

V. articulatum⁸

(2S)-Homoeriodictyol 7,4’-di-O-β-D-glucopyranoside (66) V. coloratum⁵ (2R)-Eriodictyol 7,4’-di-O-β-D-glucopyranoside (67) V. coloratum⁵ (2S)-7,4’-Dihydroxy-5,3’-dimethoxyflavanone (68) V. coloratum² (2S)-Homoeriodictyol-7-O-[apiosyl(1→2)]-glucoside (69) V. coloratum²

Steroid

β-Sitostenone (70) V. coloratum²

Triterpenoids

α-Amyrin (71) V. articulatum³⁴

3β-Acetoxy-urs-12-ene (72) V. coloratum²

Lupeol (73) V. coloratum²

Betulin (74) V. articulatum³⁴

3β-Acetoxy-olean-12-ene (75) V. articulatum⁸

3β-Acetoxy-lup-20(29)-ene (76) V. articulatum⁸

Oleanolic acid (77) V. articulatum⁸

Betulinic acid (78) V. articulatum³⁴

Betulonic acid (79) V. coloratum²

Ceryloleanolat (80) V. articulatum³⁵

(32)

Others

Uracile (81) V. coloratum²

Lactic acid (82) V. album L.³⁶

Inositol (83) V. articulatum³⁵

2,6-Dimethoxy-p-benzoquinone (84) V. coloratum²

(+)-epi-Quercitol (85) V. articulatum⁸

1D-1-O-Methyl-muco-inostol (86) V. album L.³⁷

Choline hydroxide(87) V. album L.³⁸

1D-1-O-Methyl-muco-inositol (88) V. album L.³⁹

Viscumitol (89) V. album L.³⁹

2,6-Dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol 6-O-[6’-O-β-D -apiofuranosyl]-β-D-glucopyranoside (90)

V. album⁴⁰

(33)

Aromatics

OH

O

OH OH

O

HO

H₃CO

O

OH

O

H₃C

HO

H₃CO

O

H₃CO

O H₃CO

HO

OCH₃ O

OH HO

O OH

OH

1 2 3

4 5 6

7 8 9

HO

H₃CO O

OH

OH OH

HO

O

10 11 12

OH

O HO O O

HO OH OH OH

O O

HO OH OH OH

圖 1-3、槲寄生(Viscum)屬植物化合物之化學結構

(34)

O HO

OH OH

OH HO

O

OH HO

O

16 17 18

OCH₃

OH HO

13 14 15

O

OH O HO

OH

OH O

HO HO

HO

H₃CO H₃CO

OH

HO

H₃CO

O O

OCH₃ OH H0 OH

O

19

21

20

HO

OH

O

OH

H₃CO H₃CO

OH

22

O

O HO

HO OH

O

OH HO OH

O O

OH HO

HO OH

O O

OH HO

HO OH

圖 1-3、槲寄生(Viscum)屬植物化合物之化學結構(續)

(35)

23

25

24

OGlc H₃CO

H₃CO

OCH₃

OGlc OH

OCH₃ HO

H₃CO

OCH₃ OH OCH₃

OH OH

O

O HO

Amino acids

NH NH O

O

HO

O

NH₂

H₂N O

OH

OH O

NH₂

S

OH NH₂

O

HO

OH NH₂

O

26 27 28

29 30 31

32

OH NH

HO O

OH NH₂

O H₂N

HO OH

O

33 34

NH₂

(36)

NH₂ O

35

HO OH

O O

NH₂

HO

NH₂ S

O

O O

OH

HO

H₂N H O

36 37

38

Catechins

O HO

OH

OH OH

O HO

O

OH OH

O

OH

HO OH

39 40

41

O HO

O

OH OH

O

OH

O OH

O HO

O

OH OH

O

OH

O OH

O HO

OH

42

(37)

Chromones

O

OH O

O O

OH

HO OH

O

OH O HO

43 44

OH

Flavonoids

O

OH O

O O

OH

HO OH

45

OH

O

OH HO

O

46

O

OH HO

O

OH

47

O H3CO

OH O

O OCH3 O

HO

OH O

OH OH

48 49 50

O HO

OH O

OH OCH3

O

O OH

OH

OH OH

OH

O H3CO

OH O

O

OH

O OH

OH OH

OH

51 52

OH H3CO

OCH₃O

O

O OH

OH OH

(38)

OH H₃CO

OCH₃ O

O OCH₃

O OH

OH OH

OH

53

O O

OH O

OH OCH₃

O

HO OH

OH OH

54

O H₃CO

OCH₃ O

O OCH₃

O OH

OH OH

OH

55 56

OH H₃CO

OCH₃O

O OCH₃

O O

OH OH

OH O HO OH

OH

O O

OH O

OH OCH₃

O

HO OH OH

O

O OH

OH OH O O

OH OH HO

57 58

O O

OH O

OH OH

O

HO OH

OH OH

O H₃CO

OH O

O OCH₃

O O

OH OH

OH O HO OH

OH

59 60

O H₃CO

OH O

O OCH₃

O O

OH OH

OH O HO OH

OH

(39)

61 62

63 64

65 66

O O

OH O O

HO OH OH OH

O O

OH O O

O HO

HO

OH

O OH

OH

O OH

OH OH O

O O

OH O O

O HO

HO

OH

O OH

OH OH O

OCH₃

HO

O

OH O

O

OH HO

HO O

O O

OH HO O

OH OH

O OH

OH OH O

O

O O

OH O O

O HO

HO

OH

O OH

OH O

O O

OH O

O OCH₃

O OH

OH OH

OH O

HO OH OH OH

(40)

O HO

OCH₃ O

OH OCH₃

67 68

O O

OH O

O OH

OH OH

OH O

HO OH OH OH

O O

OH O O

O HO

HO

OH

O OH

OH OH

69

OH OCH₃

Steroids

H H H

O

70

(41)

Triterpenoids

HO

H

H H

O

H

O H HO

H

HO

H H

H

71

72

73

H OH

74

75

76

O

H

O H O

H

O

HO

H

H H

O OH

77 78

HO

H H

H

H OH

O

79

O

H

H OH

O

HO

O O

80

(42)

Others

81 82 83

84 85 86

87 88 89

90

HN NH O

O

HO O

OH

OH OH

OH OH HO

HO

O

H₃CO CHO

O

OH HO

HO

OH OH

OH

HO

OH H₃CO

OH

N⁺ HO

-O H

OH

HO

OH H₃CO

OH

OH OH

H₃CO

OH H₃CO

OH

O

HO OH O

O

HO

O

OH

HO OH

HO H

(43)

第第第

第二二二章二章章、章、、材料與方法、材料與方法材料與方法材料與方法

第一節第一節第一節

第一節實驗儀器與藥品實驗儀器與藥品實驗儀器與藥品實驗儀器與藥品

一、層析 (Chromatography)

(一) 管柱層析 (Column Chromatography) 1.管柱：不同口徑長度之玻璃管柱

2.填充物：E. Merck silica gel 60 F254，70-230 mesh

.E. Merck silica gel 60 F

254，230-460 mesh (二) 薄層層析 (Thin-layer Chromatography)

1.分析型 TLC 片：E. Merck Kieselgel 60 F254 silica gel，

pre-coated aluminum plate or glass plate，

0.2 mm

2.製備型 TLC 片：E. Merck Kieselgel 60 F254 silica gel，

pre-coated glass plate，1 mm

(三) 高效液相層析 (High Performance Liquid Chromatography) 1.幫浦(pump)：Shimadzu LC-6AD Liquid Chromatograph Dynamax model SD-200 solvent delivery

system

2.管柱(Column)：E. Merck Li Chrosorb Si 60 (7 µm) Waters RP-18 ( 5 µm )，10×250 nm

3.檢測器：Shimadzu SPD-6AV UV-VIS Spectrophotometric

(44)

detector, Dynamax model UV-1 adsorbance detector

二、光譜分析儀器

(一) 紅外線光譜 (Infrared spectra IR): Nicolet Avatar 320 FT-IR (二) 核磁共振光譜 (Nuclear Magnetic Resonance Spectra, NMR)

1.Varian Gemini (200 MHz) FT-NMR 2.Bruker AC-400 (400 MHz) FT-NMR 3.Varian Gemini (500 MHz) FT-NMR

內部標準(internal standard)：TMS (tetramethyl silane)

信號表示：分別以 s、d、t、m、dd 及 br，代表 singlet、doublt、

triplet、multiplet、double doublet 及 broad。

三、質譜儀器 (Mass Spectra)

1.Joel JMS-HX 110 Mass Spectrophotometer (國立中國醫藥研究所) 2.Shimadzu LCMS ITTOF Spectrophotometer (國立台灣大學貴儀中心)

四、熔點測定 (Melting Point) Yanaco micro melting point apparatus

五、TLC spots 之檢出

1. UV (長波 365 nm, 短波 254 nm) 2. 5％硫酸溶液

(45)

3. Libermann Burchard’s reagent 檢測 triterpene

六、濃縮機

1.Buchi B-480 Waterbath 2.Buchi R-114 Rotavapor

3.Buchi B-720 vacuum controller

七、溶劑

正己烷 n-Hexane

.GR or AR

二氯甲烷 Dichloromethane

.GR or AR

氯仿 Chloroform GR or AR 乙酸乙酯 Ethyl acetate GR or AR 甲醇 Methanol GR or AR 丙酮 Acetone GR or AR 乙醇 Ethanol 95%

(46)

第二節第二節第二節

第二節椆櫟柿寄生化學成分之萃取與分離椆櫟柿寄生化學成分之萃取與分離椆櫟柿寄生化學成分之萃取與分離椆櫟柿寄生化學成分之萃取與分離

一、植物來源

黃士元博士於 95 年 02 月，於台中縣大坑鄉東山里大楓香樹上採集並鑑定，乾重 22.5 kg。

二、椆櫟柿寄生萃取與分離流程

椆櫟柿寄生乾重 22.5 kg，以 95%酒精加熱萃取五次，經減壓濃縮後得到 2.24 kg 的酒精粗萃物(crude extract)。將粗萃物以正己烷 (n-Hexane)及水進行液相分配(partition)後，得到正己烷層及水層，

正己烷層經減壓濃縮後得乾重 500.0 g。再將乙酸乙酯(EtOAc)與水層進行液相分配，得到乙酸乙酯層與水層，乙酸乙酯層經減壓濃縮後得乾重 463.6 g。最後，將正丁醇(Butanol)與水層進行液相分配，

得到正丁醇層與水層，正丁醇層經減壓濃縮後得乾重 354.0 g。

乙酸乙酯層進行矽膠管柱層析，利用正己烷/氯仿(CHCl3)以 100:1 至 0:1 進行梯度沖提，再以氯仿/甲醇(MeOH)由 100:1 至 1:1 進行梯度沖提，共分得 14 個部份(Fr. 1～14)。

第 6 部分(Fr. 6)進行矽膠管柱層析，利用正己烷/二氯甲烷 (CH2Cl2)以 10:1 至 0:1 進行梯度沖提，再以二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇由 40:1:0 至 1:1:1 進行梯度沖提，共分得 14 個部份(Fr. 6-1～6-14)；

第 7 部份經由 Sephadex LH-20 管柱色層分析，以二氯甲烷/甲醇 1:3 進行沖提，共分得 6 個部份(6-7-1～6-7-6)；第 5 部份經由 Sephadex

(47)

LH-20 管柱色層分析，以氯仿/甲醇 1:1 進行沖提，得到化合物 12 (214.0 mg)。

第 10 部份(Fr. 10)進行矽膠管柱層析，利用二氯甲烷(CH2Cl2)/

丙酮(Acetone)/甲醇以 40:1:0 至 2:2:1 進行梯度沖提，共分得 19 個部 份(10-1～10-19)；第 14 部份(10-14)以再結晶的方式得到化合物 1 (255.0 mg)，溶解的部分經由 Sephadex LH-20 管柱色層分析，以甲 醇/丙酮 10:1 進行沖提，得到化合物 2 (195.0 mg)。第 15 部份(10-15) 以再結晶的方式得到化合物 5 (432.0 mg)。第 16 部份(10-16)經由 Sephadex LH-20 管柱色層分析，以甲醇進行沖提，得到 3 個部份 (10-16-1～10-16-3)，第 2 部分經由 Sephadex LH-20 管柱色層分析，

以氯仿/甲醇 1:3 進行沖提，得到化合物 4 (60.3 mg)。第 17 部份(10-17) 經由 Sephadex LH-20 管柱色層分析，以甲醇進行沖提，得到 8 個部份(10-17-1～10-17-8)；第 4 部份(10-17-4)進行矽膠管柱層析，利用正己烷/氯仿以 10:1 至 0:1 進行梯度沖提，再以氯仿/甲醇由 50:1 至 1:1 進行梯度沖提，共分得 13 個部份(10-17-4-1～10-17-4-13)；第 7 部份(10-17-4-7)利用逆向的高效液相層析儀(HPLC)，以 65%甲醇進 行沖提，得到化合物 9 (63.8 mg)、化合物 10 (27.2 mg)；第 10 部份 (10-17-4-10) 利用逆向的高效液相層析儀 (HPLC) ，以 30% 乙腈 (Acetonitrile)進行沖提，得到化合物 11 (2.8 mg)。第 7 部分(10-17-7) 利用製備型薄層色層分析板(P. TLC)，以氯仿/甲醇 8:1 作為展開液展 開，得到化合物 3 (33.3 mg)、化合物 8 (13.2 mg)。

第 12 部分(Fr. 12)經由 Sephadex LH-20 管柱色層分析，以甲醇

(48)

進行沖提，得到 6 個部份(12-1～12-6)，由第 4 部份得到化合物 6

(171.0 mg)；而第 5 部份經由 Sephadex LH-20，以甲醇進行沖提，得

到化合物 7 (7.7 mg)。

(49)

Whole plant of Viscum articulatum (22.5 kg)

Extracted at 55℃℃℃℃ with 95% ethanol. (40 L ×××× 5)

crude extract (2.24 kg)

n-Hexane and H₂O (1：：：：1) partition

n-Hexane layer (500 g) H₂O layer

EtOAc and H₂O (1：：：：1) partition

EtOAc layer (463.6 g) H₂O layer

Butanol and H₂O (1：：：：1) partition

Butanol layer (354.0 g) H₂O layer

Fr.1 Fr.6 Fr.10 Fr.12 Fr.14

Silica gel column

1. n-Hexane/CHCl₃100:1 →→→ 0:1→ 2. CHCl₃/MeOH 100:1 →→→→ 1:1

Silica gel column 1. n-Hexane/CH₂Cl₂

10:1 →→→ 0:1→

2. CH₂Cl₂/EtOAc/MeOH 40:1:0 →→→→ 1:1:1

6-6 6-7

LH-20

CH₂Cl₂/MeOH 1:3

6-6-4 6-7-5

LH-20 CHCl₃/MeOH 1:1

12

^{(214.0 mg)}

下頁續下頁續下頁續下頁續

LH-20 MeOH

6

^{(171.0 mg)} ^12-5

LH-20 MeOH

7

^{(7.7 mg)}

圖 2-1、椆櫟柿寄生之化學成分萃取與分離流程(一)

國立台東大學生命科學研究所 碩士論文