斑馬魚端腦在空間記憶上所扮演的角色
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(2) 壹、中文摘要 記憶會以多元方式於大腦神經細胞中形成及儲存，並可因應需求 而重新喚回及表現已儲存之記憶。海馬迴為哺乳類與大部分陸地脊椎 動物腦內，與空間記憶有關之重要腦區。實驗證實硬骨魚的端腦同源 於哺乳類的海馬迴，負責空間相關之學習與記憶等認知功能。 本研究採用改良型之斑馬魚 T 字形迷宮，合併學習前或學習後之 端腦破壞處理，以探討斑馬魚之端腦與空間記憶之關聯，及其在記憶 習得（acquisition） 、保存（retention）與提取（retrieval）過程中的重 要性。實驗結果顯示， 1.雙側端腦破壞不會影響斑馬魚的自發性探 索行為，卻會明顯干擾空間記憶的習得、保存與表現。2.學習前的雙 側端腦破壞，會同時影響長期記憶，及短期記憶的獲取與表現。3.學 習後的雙側端腦破壞，會破壞先前已建立之空間記憶，顯示不論是長 期或短期的空間記憶形成，皆需要端腦腦區（telencephalon）的參與。 4. 此外，學習後的左側端腦破壞，使斑馬魚無法正常表現先前已建 立之空間記憶。5.學習前右側端腦破壞，使斑馬魚出現空間記憶學習 障礙。這些結果顯示，左、右端腦半球在空間記憶形成過程中，具有 功能上的不對稱性。使左、右端腦分別在空間的學習與記憶上，具有 不同程度的優勢性。 綜合以上各點，本研究證實端腦在斑馬魚空間學習與記憶上扮演. 1.
(3) 重要的角色，且參與層面廣涵空間記憶的習得、保存、提取與表現。 此外，初步證實斑馬魚端腦左、右側可能與哺乳類相似具有空間定位 優勢性。此結果不但可作為與其他物種在神經生理學上及演化的比 較，且有助斑馬魚模式於神經科學研究應用之推廣。. 2.
(4) 貳、英文摘要 Abstract Memory which stores and deals with all requirements of existence is formed in various ways in the nerve cells of the brain. Hippocampus is critical for the formation of spatial memory in mammals and land vertebrates. The telencephalon in teleost fish is homologous to the hippocampus of mammalian, which is specifically involved in spatial learning and memory. The present study was aimed to study possible role of telencephalon on the spatial learning and memory in zebrafish. Which include the importance of telencephalon on the acquisition, retention, and retrieval of spatial memories. To achieve this goal, we used modified T-maze paradigm combined with specific lesion of telencephalon before and after spatial learning. Results showed: 1. Either global or unilateral lesion of the telencephalon has no impacts for locomotor activity but deficit the acquisition, retention and retrieval of spatial memory. 2. Lesion of the telencephalon impairs not only the long-term but also the short-term memory. 3. Functional asymmetric of telencephalon on spatial learning has been found in zebrafish. 4. Right side telencephalon is dominant for the spatial learning and memory. According to our results, we concluded that telencephalon plays a vital role of spatial learning and memory in zebrafish on the acquisition, retention, and retrieval of spatial memory. The telencephalon of zebrafish has cerebral lateralization which is similar to mammals. The results gathering from this study can be applied to the comparative neurophysiological studies between different species. But also extend the usage of zebrafish model on neuroscience research. 3.
(5) 縮寫表 CPP. conditioned place preference. 情境線索. LTM. long-term memory. 長期記憶. LTP. long-term potentiation. 長期增益. LP. telencephalic lateral pallia. 端腦旁側腦區. NMDA. N-methyl-D-aspartate. N-甲基-D-天冬胺酸. MP. telencephalic medial pallia. 端腦中側腦區. MTL. medial temporal lobe. 顳葉中側. STM. short-term memory. 短期記憶. 4.
(6) 參、緒論 一、研究背景（Study Background）. A.學習與記憶（learning and memory） 1.學習與記憶的定義 (Definition of learning and memory) 學習與記憶可由許多方面來定義。簡單的定義為對過去的經驗的 喚回與重現(Tully, Bourtchouladze, Scott, & Tallman, 2003)。從行為方 面來定義，學習是由外界獲得經驗的過程，記憶是保存學習的成果。 從細胞分子方面來定義，外界重複的刺激訊息輸入，造成神經細胞在 功能與結構上些微的調整修飾，故記憶可視為神經可塑性（neuronal plasticity）的結果(Richardson, 1996; Squire, 1987)。 神經系統在學習與記憶的過程中，分別透過習得（acquisition）、 固化（consolidation） 、保留（retention）與提取（retrieval）等四個階 段來處理訊息(Tully, Bourtchouladze, Scott, & Tallman, 2003)。習得是 記憶開始的階段，外界訊息的輸入與編碼過程。習得具有選擇性，僅 有環境中較為引人注目的刺激，才能透過感官傳入之訊息形成記憶。 固化則是將已習得的訊息鞏固的過程。保留是維持已固化記憶的過 程。提取是指將保留的訊息，經由特定刺激，如相似的環境與線索， 能夠被重新恢復及表現出來的過程，即記憶的喚回與重現(Alberini, Milekic, & Tronel, 2006)。. 5.
(7) 2.記憶的分類 (Classification of memories). 記憶分為幾種不同的型態且與不同的腦區有關。依據被提取的方 式來分類，可將記憶分為外顯性（explicit）與內隱性（implicit）的記 憶，分別又稱為陳述性（declarative）與非陳述性（non-declarative） 記憶。陳述性記憶為有意識地回憶過去所發生的事，屬於事實、觀念 及事件的記憶，例如今早與朋友對話的內容；非陳述性記憶則為自動 化與反射的反應，無法清楚地以言語陳述，而是利用行為表現來顯示 該記憶，例如運動技能、習慣、情緒學習以及基本的反射反應 (Richardson, 1996)。由於陳述性記憶是兩個不同刺激間形成聯結，通 常獲取迅速，甚至能夠藉由單一次的經驗而習得(Squire & Zola, 1996)。 依 據 記 憶 保 存 時 間 長 短 ， 記 憶 亦 可 分 為 工 作 記 憶 (working memory)、短期記憶（short-term memory, STM）及長期記憶（long-term memory, LTM）三大類。工作記憶為工作過程中短暫的記憶。訊息初 獲得時期為短期記憶，此時新習得的經驗剛成形，較為短暫且不穩 定，需經由適當的固化過程（通常是重複與休息）來轉化為更持久的 長期記憶(Alberini, Milekic, & Tronel, 2006; Tully, Bourtchouladze, Scott, & Tallman, 2003)。. 6.
(8) 3.學習與記憶相關腦區 (Brain structures essential for the learning and memory) 記憶的形成及貯存並非位在大腦的單一位置，而是藉由數個分散 的腦區，或數個不同的系統共同組成(Squire & Zola, 1996)。前人的研 究顯示，陳述性記憶由顳葉中側（medial temporal lobe, MTL）海馬迴 （hippocampus） 、間腦（diencephalon）表現，而不同形式的非陳述性 記憶則在大腦不同區域表現，例如小腦（cerebellum）參與運動學習 以及肌肉協調相關記憶。杏仁核（amygdala）與恐懼等情感、情緒記 憶處理相關。紋狀體（striatum）為習慣性或技能性記憶神經迴路之 一。新皮質（neocortex）一般認為與啟動效應（priming effect）相關。 啟動效應為內隱性記憶的主要形式之一，為經歷過的類似事件或任務 時引發的促進作用。其他非陳述性記憶，則與反射性反應所用到的特 定知覺與運動系統有關(Richard, 1996)。 事實與事件（陳述性記憶）與非意識的學習（非陳述性記憶）， 這兩大類記憶獲得的方式不同，此外，非陳述性記憶可在無意識下透 過行為表現呈現。記憶有許多種類，其儲存、表現也具多樣性，此種 記憶多元系統(multiple memory systems)的觀念，是根據研究雙側顳葉 內側或間腦損傷而造成失憶症（amnesia）的患者而來。某些因部分 腦區損傷造成失憶症的個案，其陳述性記憶嚴重缺損，如空間位置的. 7.
(9) 重新確認與喚回、臉譜記憶與音樂旋律等；然而，這些失憶症個案其 他的學習與記憶能力，如技巧與習慣化學習，卻與常人無異，顯示這 些類型的記憶能夠建立與保存在未受損的腦區中，且能夠被正常提取 及喚回(Squire & Knowlton, 1995; Squire & Zola, 1996)。最有名的臨床 病例是在 1957 年，由 Scoville 與 Milner 研究 Herry M.(H.M.)的病例 研究。H.M. 幼年時因摔傷頭部引起癲癇，1953 年情況逐漸惡化且無 法藉由藥物控制，故醫師決定對引發異常之腦區域進行手術，切除大 腦雙側顳葉內側。包含海馬迴、杏仁核與鄰近大腦皮質層等構造，術 後其癲癇情形獲改善，但卻造成嚴重的順向失憶症（anterograde amnesia）(Corkin, 2002)。 針對病例的研究顯示，單側海馬迴的損傷亦會造成記憶的缺損 (Squire, 1992)。研究哺乳類動物與人類疾病的結果發現，海馬迴受損 後，會造成陳述性記憶無法建立的現象(Eichenbaum, Dudchenko, Wood, Shapiro, & Tanila, 1999; Hartley, Maguire, Spiers, & Burgess, 2003)。動物實驗模式如大鼠、猴子的研究觀察，也支持臨床觀察的 結果，認為海馬迴與記憶具密切的關聯(Jarrard, 1993; Malkova & Mishkin, 2003; Squire, 1992)。. 8.
(10) B.空間記憶（Spatial memory） 1.認知地圖的形成（位置細胞） 導航（navigation）是一種朝正確目的地前進，過程中不斷進行修 正的行為過程(Franz & Mallot, 2000)。認知心理學與神經科學，定義 空 間 記 憶 （ spatial memory） 為 紀 錄 該 生 物 生 存 環 境 與 空 間 定 位 （orientation）的一種記憶型態。例如人類生活在城市中需要空間記 憶來穿梭於街道巷弄間(Hartley, Maguire, Spiers, & Burgess, 2003)；如 同實驗中的大白鼠需要此能力，來尋找並記憶食物位在迷宮的位置一 般。動物具有空間定位的能力，使其能夠記憶並往返於特定位置間， 如獲取食物、水源，躲避掠奪者或尋找同伴(Alves, Chichery, Boal, & Dickel, 2007)。總結過去研究發現，形成空間學習所需的構造，廣泛 地存在哺乳類動物、鳥類、硬骨魚類與非脊椎動物的中樞神經系統內 (Adolf, et al., 2006; Alves, Chichery, Boal, & Dickel, 2007; Hartley, Maguire, Spiers, & Burgess, 2003; Salas, Broglio, & Rodriguez, 2003)。 1932 年 Tolman 在實驗中證實，大白鼠能夠在迷宮中找到通往食 物的路徑；且會另闢新的路徑，大白鼠會使用捷徑，而非原先習得的 路徑，改以繞道方式抵達目標所在地，此為導航能力的展現。此外， 他認為大白鼠可藉由腦內的地圖，將環境在大腦中重現，並據此定位 出迷宮的終點，但卻因為缺乏神經機轉相關證實而備受質疑(Tolman,. 9.
(11) 1932)。 後續的科學家以神經心理學與電生理學方式進行動物實驗，研究 海馬迴的訊息處理過程，發現海馬迴能以神經活動方式，將物理性空 間表現出來，也就是目前公認的認知地圖（cognitive map）觀念。他 們發現大白鼠於進入某特定位置時，其海馬迴的部分神經元動作電位 會增加，而能夠產生神經元最大反應的位置稱為神經元之位置域 （place field） ，不同海馬迴神經元具有不同的位置域，這些神經元為 位置細胞（place cell）(Eichenbaum, Dudchenko, Wood, Shapiro, & Tanila, 1999; O'Keefe & Dostrovsky, 1971; O'keefe, 1978)。 2.迷宮學習 (maze learning) 科學家為了研究動物在處理空間性任務時的活動型態，發展出許 多種評估空間記憶與表現的模式迷宮。1978 年 O’Keefe 與 Conway 以十字形迷宮（plus maze）研究發現，大白鼠的海馬迴細胞能夠接受 線索引導而表現出一種位置辨識力（place discrimination）。即使將部 分線索移除後，大部分的位置細胞仍可以維持空間所引發的動作電位 型態。這可能是因為剩餘的線索引發的神經元活動，已足夠用來定義 空間配置(O'Keefe & Conway, 1978)。1996 年 O’Keefe 年與 Burgess 更 以矩形空箱證實位置域的形狀與位置，會被空箱壁與空間的關連性影 響，也就是會隨著空箱的直徑改變(O'Keefe & Burgess, 1996)。. 10.
(12) 其他許多以迷宮訓練空間記憶習得與表現的時間發現，由於抵達 目的地使用的策略不同，習得的空間記憶可被分為幾類：反應性策略 （response strategy）是以迷宮或路線中出現的視覺等相關線索作為導 航依據以抵達目的地，而位置性策略（place strategy）則是應地應時 習得目的地與獎賞之間的關連性(Alves, Chichery, Boal, & Dickel, 2007)。將目的地設計為實驗動物偏好棲息的環境可作為一種獎賞。 實驗者設計依據實驗條件發展出空間性迷宮，使動物在迷宮中作出空 間定位後，往返於起點與目的地，並經由訓練找出捷徑或花費最少的 時間抵達標的。過去以大白鼠所進行的空間記憶實驗結果顯示，原先 對於向左或向右轉彎的偏好，使得動物在 T 字型迷宮的學習過程當中 出現天花板效應(ceiling effect)，即實驗動物原有的喜好，會干擾其學 習效果。當目的地方向與動物原先偏好的方向相同時，便能輕易地訓 練動物前往目的地，而目的地方向與偏好方向相反時，空間學習的訓 練過程會較難達成(Andrade, Alwarshetty, Sudha, & Suresh Chandra, 2001)。近期以烏賊作空間學習的研究，採用轉向偏好（side-turning preference）的設計，作為烏賊於空間記憶訓練前的前測，故意選取 與偏好相反的方向作為目的地進行訓練，以釐清動物除了使用反應性 與 位 置 性 策 略 外 ， 原 先 的 偏 好 是 否 會 影 響 空 間 學 習 效 果 (Alves, Chichery, Boal, & Dickel, 2007)。. 11.
(13) C.硬骨魚的學習與記憶（Learning and memory in teleost fish） 前人的研究證實硬骨魚部分的記憶與學習能力，其複雜度如同哺 乳類與鳥類般(Bingman, 1998; Sherry & Duff, 1996)，且具有相類似的 神經機轉。魚類曾被視為最古老的脊椎動物，僅具有未分化完全的端 腦（telencephalon）及有限的學習能力。然而，近來在發育學與神經 解剖上的研究發現，與陸地脊椎動物相比，魚類的功能、行為與大腦 演化可能具有高度的保留性。更多的實驗結果支持，陸地脊椎動物與 硬骨魚類在學習與記憶的特性與神經機轉十分相似(Salas, et al., 2006)。破壞性的實驗結果顯示，硬骨魚（teleost）的小腦為進行古典 制約性個別的運動反應時所必需的構造(Rodriguez, et al., 2005)。硬骨 魚的端腦外側腦區（telencephalic lateral pallium, LP），同源於哺乳類 動物的海馬迴，選擇性地具有空間學習與記憶能力。端腦中側腦區 （telencephalic medial pallium, MP），則同源於哺乳類動物的杏仁核 （Amygdala），在硬骨魚負責與情緒性記憶(Rodriguez, et al., 2005; Rodriguez, et al., 2002)。由這些資料可看出，硬骨魚的記憶處理與儲 存分別位在不同的腦區，這一點可能與脊椎動物相似，即大腦具有分 散的記憶系統在不同的腦區中。這樣的結果也證實了脊椎動物為適應 環境所帶來的衝擊，發展出高度保留性的記憶系統(Salas, Broglio, & Rodriguez, 2003)。. 12.
(14) 一般咸認，哺乳類、鳥類以及爬蟲類的認知地圖與相關記憶是由 海馬迴處理及形成(O'Keefe & Conway, 1978; Rodriguez, et al., 2002; Sherry & Duff, 1996)。後續的研究則證實硬骨魚的前腦（forebrain） 具有如海馬迴般負責認知地圖的能力(Broglio, et al., 2005)，剛開始辨 別硬骨魚與脊椎動物間，這一類腦區同源時並不容易。由於端腦為硬 骨魚所擁有的獨特的腦結構型態，且由單一的腦室分為兩側腦半球。 如此特殊的型態是在胚胎發育早期透過向外翻轉（eversion）的過程 所形成；而其他的脊椎動物則是經過另一種向內翻轉（evagination） 的過程，使得陸地脊椎動物具有這兩種內側與外側腦區分佈的型態 (Nieuwenhuys, 1963)。因此硬骨魚的端腦旁側腦區（LP）與端腦中側 腦區（MP）被認為相似於哺乳類的海馬迴與杏仁核。海馬迴是空間 學習與記憶關鍵，且為形成陳述性記憶的重要構造。針對這方面也有 許多功能上的研究證實，例如破壞金魚的端腦，會造成空間學習的障 礙，其結果與哺乳類與鳥類海馬迴破壞結果相似(Lopez, Broglio, Rodriguez, Thinus-Blanc, & Salas, 2000; Vargas, Bingman, Portavella, & Lopez, 2006; Vargas, Rodr inverted question markiguez, JC, Arias, & Salas, 2000)，利用分子生物技術的研究結果顯示，接受空間訓練的金 魚，其端腦外側區神經元蛋白質合成量顯著增加(Vargas, Rodr inverted question markiguez, JC, Arias, & Salas, 2000)，行為實驗則是利用迷宮 （例如 T 字形迷宮、十字形迷宮），對金魚進行空間記憶相關測試， 13.
(15) 進而證實魚類能夠形成陳述性記憶，其端腦可能為展現地圖般相關性 空間記憶系統。這些結果均支持端腦同源於陸地動物海馬迴的說法。 由於硬魚類端腦破壞對行為造成的影響，與哺乳類邊緣系統破壞 實驗結果十分相似(Lopez, Broglio, Rodriguez, Thinus-Blanc, & Salas, 2000)，故建立了魚類端腦在功能上，可能同源於陸地動物邊緣系統 的概念架構。然而，陸地動物的邊緣系統涵蓋腦區相當廣泛，包括海 馬迴（hippocampus） 、杏仁核（amygdala） 、下視丘（hypothalamus）、 韁（habenula）與乳頭體（mammillary bodies）等，負責感覺、內臟 活動的調節，且與情緒、行為、學習與記憶等活動關係密切。哺乳類 的杏仁核與海馬迴系統在條件化逃避反應（conditioned avoidance response）的習得與保存上扮演重要的角色(Rawlins, Lyford, Seferiades, Deacon, & Cassaday, 1993; Sanchez Riolobos, 1986)。前人的研究發 現，海馬迴遭破壞的哺乳類動物，在某些情境的逃避反應會被促進 (O'Keefe & Conway, 1978) ； 然 而 卻 在 痕 跡 恐 懼 制 約 （ trace fear conditioning）上造成嚴重的缺損(Phillips & LeDoux, 1992)。痕跡恐懼 制約為海馬迴所能習得的一種古典制約。實驗過程為「高頻聲音-時 間間隔-電刺激」依序方式，先提供一個非制約刺激，間隔一段時間 後再給予一個制約刺激。金魚端腦外側破壞研究中發現，痕跡恐懼制 約的保存受到損傷，但一般恐懼制約卻能正常表現(Portavella, Torres,. 14.
(16) & Salas, 2004)；此結果雷同於海馬迴受損的小鼠，無法在痕跡制約後 對聲音產生恐懼行為，然而卻在延遲型恐懼制約中表現正常(Han, et al., 2003)。 過往的實驗為了證實並釐清魚類端腦為哺乳類邊緣系統的同源 腦區，且負責空間與情緒相關記憶。故採用選擇性的端腦外側與端腦 內側破壞實驗，以便對腦區的功能做詳細的區分。實驗結果顯示，金 魚端腦外側的破壞，造成的空間記憶缺失與全端腦破壞所造成的結果 相似(Rodriguez, et al., 2002)，且端腦外側破壞並不影響提供線索的空 間學習(Lopez, Broglio, Rodriguez, Thinus-Blanc, & Salas, 2000)，由此 推論其所涵蓋的空間認知具有高度的選擇性。情緒記憶實驗中發現， 端腦內側破壞的金魚在逃避試驗中表現缺失，但不影響空間記憶的習 得與表現(Portavella & Vargas, 2005)。這些實驗結果均證實，硬骨魚 端腦與哺乳類邊緣系統具同源性，以及演化上的保留性，使得硬骨魚 具有相似於哺乳類的分散性記憶系統，且端腦可再以功能劃分出內側 與外側相對於杏仁核與海馬迴的記憶處理系統。 D.斑馬魚（Zebrafish） 斑馬魚（Danio rerio）斑馬魚是一種淡水硬骨魚，輻鰭亞綱鯉科， 一般常見的飼養觀賞魚，約在三十多年前被 George Streisinger 選來用 於實驗室作為由基因層面探討脊椎動物神經發育研究後改變了牠的. 15.
(17) 命運(Grunwald & Eisen, 2002)。Streisinger 為什麼選擇斑馬魚？原因 在今天廣泛的斑馬魚實驗研究中都能夠得到回答。斑馬魚為雙套染色 體的脊椎動物，其性別分化、免疫系統、胚胎發育等，各系統的發育 表現出脊椎動物自低等到高等的某些進化特徵，正好在簡單於複雜中 取得平衡(Guo, 2004)。此外體型小（3-4 cm），對水質接受度大，相 當易於實驗室飼養及繁殖。雌魚每次生產約 200 顆卵，卵孵化後約 2-3 個月達到性成熟，透明的胚胎更是利於解剖學特徵觀察。此物種 大 部 分 基 因 具 有 演 化 上 的 保 留 性 ， 並 與 哺 乳 類 具 同 源 性 (Cerda, Conrad, Markl, Brand, & Herrmann, 1998)。因此實驗者能夠使用基因 工程，產生大量的突變斑馬魚群體應用在基因與生藥研究上(Ninkovic, et al., 2006)。近年來以斑馬魚基因發展的突變種類涵蓋數以千計，包 含以基因突變技術改變 AChE （acetylcholine esterase）活性，延緩老 化對認知造成的改變(Yu, Tucci, Kishi, & Zhdanova, 2006)。由於斑馬 魚是一種在基因與發育上皆有良好描述定義的脊椎動物，過去以大鼠 來探討基因與環境因素對認知退化造成的影響所驗證出的結果，亦可 利用斑馬魚作為動物模式來研究。 斑馬魚最初的運動行為出現在受精後 17 小時的自發性收縮，為 簡單的脊椎網路利用初級運動、感覺與中間神經元所引發 (Saint-Amant & Drapeau, 2001)。27 小時後對於輕微的觸碰能夠產生. 16.
(18) 游開一小段距離的反應。五天大的幼魚，可對碰撞產成逃離反應 (escape response)，且能夠學習以線索誘發的反射運動，例如以視覺線 索引發的視運動（optomotor response）反應，以物理性感覺線索引發 的逃離反應，另外還有以餵食或避開掠奪者訓練出的目標導向 （goal-directed）運動。斑馬魚生性活潑好動，在分子生物學上適合 作為基因轉殖後行為觀察研究、生態學上的水質試驗或神經科學上的 學習與記憶訓練，因此許多相關的行為實驗也應運而生。 斑馬魚偏好與相同魚群種類群聚，並形成團隊及群體行動。同 一群體以適當距離聚游，此行為可有效對抗掠食者。斑馬魚是晝行性 魚種，白天時偏好逗留在光亮處而不願停留黑暗處，但遇到危險時則 會反應性地躲向暗處。這些行為特性使斑馬魚在近年來，常用以研究 較複雜的行為。近期的文獻指出，斑馬魚具有與哺乳類相似的空間學 習能力，實驗者利用斑馬魚的偏好或以食物作為學習誘因，進行 T 字型迷宮的實驗。結果發現，當斑馬魚經過兩次空間學習訓練後，便 能成功建立前往目的地的空間記憶(Darland & Dowling, 2001)。如在 水中投予 glutamate NMDA receptor antagonist（MK-801） ，會干擾斑 馬魚在 T 字型迷宮中的學習能力(Swain, Sigstad, & Scalzo, 2004)。其 他行為實驗尚有：主動逃避(Xu, Scott-Scheiern, Kempker, & Simons, 2007)、空間適應(Sovrano, Bisazza, & Vallortigara, 2007)及空間學習記. 17.
(19) 憶(Colwill, Raymond, Ferreira, & Escudero, 2005; Williams, White, & Messer, 2002)，或以藥物作為獎賞（rewarding）之條件線索傾好 （conditioned place preference, CPP）模式誘導出成癮行為，應用於檢 測藥物濫用效果與基因轉殖後篩選分析(Darland & Dowling, 2001; Levin, Limpuangthip, Rachakonda, & Peterson, 2006; Ninkovic & Bally-Cuif, 2006; Yang, 2003; Yu, Tucci, Kishi, & Zhdanova, 2006)。 長期增益現象（long-term potentiation, LTP）是海馬迴與杏仁核 電生理實驗當中，廣泛用於探討學習與記憶之形成機制。麩胺酸 N-methyl-D-aspartate （NMDA）receptor 受興奮性胺基酸-麩胺酸 （glutamate）活化，為與突觸可塑性（neuronal synaptic plasticity）相 關受體，更為建立 LTP 神經機轉所必須。哺乳類研究結果顯示，位 於海馬迴的 glutamate NMDA receptor 參與學習與記憶的建立過程， 投予 glutamate NMDA receptor 拮抗劑可干擾動物之空間學習與記憶 (Morris, 1989)。活體 （in vivo）電生理實驗結果顯示，斑馬魚端腦 可形成 LTP，而利用 glutamate NMDA receptor 拮抗劑可阻斷 LTP 的 形成(Nam, Kim, & Lee, 2007)。這些實驗結果支持斑馬魚端腦區具有 神經突觸可塑能力，且可能參與相關的學習與記憶之建立。 過去的魚類端腦腦區破壞探討空間記憶之實驗以金魚（goldfish） 居 多 (Lopez, Broglio, Rodriguez, Thinus-Blanc, & Salas, 2000; Portavella & Vargas, 2005; Vargas, Bingman, Portavella, & Lopez, 18.
(20) 2006)，缺少以斑馬魚端腦破壞探討空間學習的文獻。利用斑馬魚的 優勢例如胚胎期短（2-3 天） 、器官形成過程易於觀察、性成熟期短（3 個月）、能夠以物理及化學方式產生突變魚，或以分子生物學方法改 變特定基因的表現及產生基因轉殖魚等，加上基因體解碼計畫完成， 目前斑馬魚成為遺傳發育研究領域頗負盛名的模式動物。這些上述特 性，我們選擇使用斑馬魚探討端腦破壞是否影響空間學習的習得、保 存與表現，希望藉此證實其端腦同源於哺乳類海馬回在空間記憶上扮 演重要的角色，並以此結果做為未來發展以斑馬魚研究空間記憶的模 式動物，結合轉殖基因技術以及斑馬魚胚胎透明利於在發育期間作階 段觀察的優勢，發展研究先天神經系統缺陷疾病的動物模式。. 二、研究目的（Study purposes） A.透過空間訓練前的全端腦手術破壞方式，探討斑馬魚端腦在空間 記憶習得過程中的重要性，是否參與空間相關長期記憶與短期記憶 形成與保存。 B.透過空間訓練後的全端腦手術破壞方式，探討破壞斑馬魚端腦影 響已形成之空間記憶提取表現。 C.透過學習前、後之左、右側端腦半球破壞手術方式，探討斑馬魚 端腦是否具有功能不對稱性。. 19.
(21) 肆、研究材料與方法 A.實驗動物（Animals） 實驗動物為年齡三個月以上成熟斑馬魚，體長約四公分。動物於 實驗期間飼養於師大生命科學系動物房，環境溫度維持於 28℃左右， 光週期控制為晝夜 14/10 小時。實驗斑馬魚為中研院細胞與生物個體 研究所（Institute of Cell and Organismic Biology, Academia Sinica）提 供，後由本實驗室自行繁殖、飼養，參考 Westerfield(Westerfield, 1995) 所建立之飼育方法，且受師大實驗動物管理小組之監督。本研究所採 用的研究方法，就由國立台灣師範大學實驗動物管理委員會審核通過 後進行，並符合農委會所訂定實驗動物使用規章。. B.行為試驗儀器（Apparatus） 1.自發性探索行為（locomotor activity） 在此訓練中，我們的目的在於觀察斑馬魚處在一個新的地點以及 適應這個地點後，分別展現的游泳速率與游泳地點。希望藉瞭解為手 術前、後斑馬魚游泳型態是否被影響，此外作為實驗前的作自發性探 索行為能力與基本運動功能初步篩選。魚類被個別放置於小的實驗圓 形水槽（直徑 22cm，高 20cm），內置水位高 8 cm，實驗儀器上方均 勻照明。牠們的行為將以影像偵測系統（Etho Vision）錄影觀察紀錄，. 20.
(22) 主要的觀察項目，為單位時間內斑馬魚的總泳動距離 (total distance moved)。 2. T 字型迷宮（T-maze） 學習與記憶測試訓練於 T 字型迷宮進行。此 T 字型迷宮改良自 Darland and Dowling（2001） 。水道內控制為 1-2 cm 淺水位，斑馬魚 可游行於 18 英吋的長臂中，並且有兩個 12 英吋的短臂可選擇。短臂 通往 9 平方英吋的深水槽，實驗過程中依據條件僅有單側深水槽開 放。訓練開始前，斑馬魚於長臂起始處等待並適應。訓練開始時，斑 馬魚自長臂游向 T-junction，也就是長、短臂交接處，再選擇游向左 或右側短臂。開放側深水槽內置有人工水草與卵石，營造斑馬魚偏好 的棲息地環境，以此環境條件作為學習誘因，訓練斑馬魚習得空間記 憶。主要的觀察項目，為斑馬魚完成迷宮實驗所需時間 (latency time)。. C.空間訓練程序（Behavior procedure） 1.馴化階段 (Acclimation, A) 訓練階段開始前一個小時，將動物置於T字形迷宮中。兩側短臂 以不透明隔板關閉，隱藏深水槽。斑馬魚T字形水道淺水區自由探索 環境10分鐘，使之熟悉陌生的環境，避免在正式訓練中受到自然行為 活動量的干擾，且不開放深水槽可避免動物在訓練前產生對右邊開放. 21.
(23) 臂(open arm)的偏好。此階段結束後，動物回到魚缸內休息。 2.訓練階段（Trial,T and test） 連續三個訓練天，斑馬魚被放置在T字形迷宮中。訓練時期，右 邊深水槽隔板移開，斑馬魚將能學習自等待區前往深水槽的正確路 徑。實驗紀錄動物自閘門（等待區）開啟後第一次進入深水槽中且停 留時間超過20秒鐘所花費的時間。每次訓練時間為5分鐘，若未在時 間範圍內抵達目標地，將輕柔驅趕斑馬魚前往深水區，並靜待動物持 續逗留2分鐘以上再送返飼育缸。 空間訓練實驗流程圖：. A. T1 1 hr. T2 1 day. Test 1 day. A: Acclimation T1: Trial 1 T2: Trial 2. 3.探討空間記憶習得、保存與表現實驗 a.端腦破壞對空間記憶習得的影響 為探討端腦是否為空間記憶習得（acquisition）所必需，動物於 進行訓練前接受全端腦破壞手術，並在手術前後分別施以自發性探索 行為，以證明其運動功能正常後，再進行行為訓練。. 22.
(24) S. L. A. L. 1 day. 5 days. 1 day. L: Locomotor activity A: Acclimation T1: Trial 1 T2: Trial 2. T1 1 hr. T2 1 day. Test 1 day. S: Surgery. b.端腦破壞對空間記憶保存與提取表現的影響 於動物習得空間記憶後，再執行全端腦破壞手術，以探討端腦與 空間記憶保存（retention）及提取（retrieval）之關聯。. L 1day. A. T1 1hr. T2 1day. L: Locomotor activity A: Acclimation T1: Trial 1 T2: Trial 2. Test 1day. L 1day 1day. S. L 5days. 1day. Retest 1day. ReT1 1day. ReT2. ReT3. 1day. S: Surgery ReT1: Retrain 1 ReT2: Retrain 2 ReT3: Retrain 3. 23.
(25) D.端腦手術（Surgery） 按實驗目的，於行為實驗前或實驗後，動物隨機分成三組，接受 不同類型之端腦破壞（lesion）手術，假手術（sham）對照組，以及 保持原狀動物（naive）控制組。手術之前，動物予浸泡於含麻藥的 水中麻醉(0.2%的Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)（A5040, Sigma, USA），接著移至手術平台上，提供持續輸送含氧水流之微管 於口中固定，透過點滴裝置使含氧與麻醉藥流動經過魚鰓，確保動物 在整個手術期間狀態穩定。在雙目顯微鏡下開始手術，首先將背部皮 膚和頭顱骨小心的移除打開，吸除腦膜以適當的暴露出腦部。端腦破 壞手術組，依據實驗設計將被移除雙側端腦或單側端腦。利用連結的 真空裝置（10 ml 塑膠針筒+蝴蝶針管）的玻璃微毛細管以手控方式 吸除。破壞後，先前移開的頭顱骨片段將被重新放置回原始的位置， 並使用黏膠（cyanocrilate glue, Vetbone, 1469SB, 3M, U.S.A.）覆蓋。 假手術組將被執行相當步驟，唯神經組織將不被受損傷破壞。接受手 術後，動物回到飼養水槽度過7天的復原期。. 24.
(26) E.腦部組織破壞程度檢定（Representation of brain） 實驗結束後，實驗魚被施以過量麻醉後。於鰓蓋平行處切斷頭部 後，以4 % 福馬林溶灌流。魚腦組織稍後將被取出，並利用雙眼顯微 鏡檢視評估先前破壞的程度。之後魚腦以10%福馬林進行後固定（post fixation）三小時以上，再以雙眼顯微鏡搭配攝影設備，將灌流固定後 的腦部拍攝成為圖檔. F.統計方法（Statistics）。 實驗結果均利用JMP統計軟體作分析。所有自發性探索行為與空 間學習行為數值皆以mean + SEM表示，呈現學習前、後配合腦部破 壞或以手術破壞不同腦區後，對於空間記憶之習得、固化、保留或提 取造成之差異。自發性探索行為實驗中，主要比較游泳組距離 （distance moved）與速率（velocity）在術前與術後之差異。空間訓 練實驗則是比較手術破壞組與腦區完整組在T字形迷宮中抵達目的所 花 費 時 間 （ latency of time ） 之 差 異 。 實 驗 數 據 採 用 ANOVA repeated-measures ANOVA分析，並配合後設檢定，p≤0.05被認定具有 統計上的顯著差異。. 25.
(27) 伍、實驗結果 實驗一、 利用手術破壞斑馬魚雙側端腦的方式，配合 T 字形迷宮訓練，探 討斑馬魚端腦在空間記憶習得（acquisition）過程中的重要性。 A. 實驗設計說明： 本實驗使用 24 隻斑馬魚，平均分為三組，分別接受不同的手術 處理，於手術後讓動物休養五天，再進行 T 字形迷宮的空間記憶訓 練，以觀察端腦破壞對動物運動功能及空間記憶習得過程的影響。空 間記憶訓練方式，為連續三個實驗天，每天一次 trial，第三天的 trial 等同於 test，目的在於測試斑馬魚是否經由連續的訓練習得空間記 憶。並於行為測試結束後，經灌流處理後取出動物腦部，以觀察手術 破壞程度，各組手術方式如下： Group one：naïve 組 實驗控制組，不作任何手術。 Group two：sham 組 偽手術組，僅打開端腦上方頭蓋骨並重新黏合，但保持端腦之完整。 Group three：lesion 組 雙側端腦破壞組，打開端腦上方頭蓋骨，並以手術破壞雙側端腦，並 重新黏合頭蓋骨。. 26.
(28) 實驗一之手術與行為實驗之流程圖：. S. L 1 day. A. L 5 days. L: Locomotor activity A: Acclimation T1: Trial 1 T2: Trial 2. 1 day. T1 1 hr. T2 1 day. Test 1 day. S: Surgery. B. 實驗結果說明： 1. 自發性探索行為（Locomotor activity monitoring） 比較各組實驗動物在手術前、後表現之總游動距離與速率， 經過 one way ANOVA 分析顯示，其組間 main effect 並沒有達到 統計上的顯著水準（圖一）。表示無論實際接受手術破壞與否， naïve、sham 與 lesion 組的自發性運動行為並沒有受到明顯的影 響。顯示端腦破壞手術或打開頭蓋骨的偽手術，均不會改變動物 在自發性運動行為上的表現。此結果可作為排除手術造成動物行 為表現差異的可能性，對於往後連續的 T 字形迷宮空間訓練相當 重要。. 27.
(29) 2. T 字形迷宮空間訓練（Spatial learning of T-maze） 空間記憶學習結果（圖二）經過 two factor with one repeated ANOVA 分析顯示 trial 間有顯著差異(p<0.001)，組內分析結果顯 示，經由 T 字形迷宮連續三天的訓練，Naïve 組與 sham 組第三天 的表現與第一天相較，皆能達到顯著差異（後設檢定 naïve 組 test 與 trial 1 相比較，p<0.05；sham 組 test 與 trial 1 相比較 p<0.01）。 顯示斑馬魚透過訓練，能夠在三天內成功建立空間記憶保存並表 現。而 lesion 組在空間記憶的習得過程中，其三天的表現間並無 顯著差異，表示端腦破壞可能造成動物失去空間學習的能力，或 影響其空間記憶的保存或表現，且明顯指出 lesion 組相較於其他 兩組在空間學習的習得過程中，產生了顯著的障礙。. 28.
(30) 實驗二、 根據實驗一的結果，進一步探討空間記憶習得期間，斑馬魚端 腦在短期記憶（short-term memory）建立過程上所扮演的角色。. A. 實驗說明： 本實驗使用 24 隻斑馬魚，依自發性運動行為測試平均分為二組， 分別接受不同的手術，於手術後讓動物休養五天，再進行 T 字形迷宮 的空間記憶訓練，以觀察端腦破壞對於動物運動功能及空間記憶習得 過程的影響。由實驗一的結果得知，端腦破壞對斑馬魚空間記憶習得 過程造成影響，且在長期記憶表現上產生障礙；此空間記憶訓練方式 以連續兩個實驗天，每天連續三次 trial，每次間隔一小時，目的在於 瞭解端腦破壞是否亦影響斑馬魚空間記憶習得過程之短期記憶的建 立。並於行為測試結束後以灌流方式取出動物腦部，以觀察手術破壞 程度，各組手術方式如下： Group one：sham 組 偽手術組，僅打開端腦上方頭蓋骨，並重新黏合，但保持端腦之完整。 Group two：lesion 組 雙側端腦破壞組，打開端腦上方頭蓋骨，並以手術破壞雙側端腦，並 重新黏合頭蓋骨。. 29.
(31) 實驗二之手術與行為實驗之流程圖：. S. L 1day. L 5 days. L: Locomotor activity A: Acclimation T1: Trial 1 T2: Trial 2. A. T1. 1day 1hr. T2 1hr. T3 1hr. T1 1day. T2 1hr. T3 1hr. S: Surgery. B. 實驗結果說明： 1. 自發性探索行為（Locomotor activity monitoring） 比較各組實驗動物在手術前、後表現之總游動距離與速率， 經過 one way ANOVA 分析顯示組間 main effect 並沒有達到統計 上的顯著水準（圖三）。表示無論實際接受手術破壞與否，sham 與 lesion 組的自發性運動行為並沒有受到明顯的影響。顯示端腦 破壞手術或打開頭蓋骨的偽手術，並不會影響動物在自發性運動 行為上的表現。此結果可排除手術造成動物行為表現差異的可能 性。. 30.
(32) 2. T 字形迷宮空間訓練（Spatial learning of T-maze） 空間記憶學習結果（圖四）經過 two factors with one repeated ANOVA 分析顯示組間有顯著差異(p<0.001)，組內分析結果顯 示，sham 組在第二天 trial 1 的表現相較於第一天 trial 1 達到統計 上的顯著（p<0.01），表示偽手術對照（sham）組空間能夠習得 相關之長期記憶，此結果與實驗一相同。且同一天的 trial 2、3 之表現與 trial 1 相比皆有統計上的顯著差異（p<0.01） ，顯示 sham 組斑馬魚能夠成功保留並表現空間相關之短期記憶。在手術 （lesion）組方面，斑馬魚在連續兩天的第一次 trial 之表現並無 顯著差異，顯示空間相關之長期記憶受到影響，此結果與實驗一 相同。評估短期記憶方面，第一天與 trial 1 分別間隔一小時之 trial 2 與 trial 3 表現未達到統計上的顯著差異，此外，第二天 trial 2 及 trail 3 與 trial 1 相比亦未達顯著差異，顯示手術破壞端腦後影 響斑馬魚空間相關之短期記憶的習得、保存與表現。. 31.
(33) 實驗三、 探討空間訓練後進行全端腦破壞對手術，對已建立保存之空間記 憶提取與表現的影響。 A. 實驗說明： 本實驗使用 40 隻斑馬魚，透過 T 字形迷宮進行空間訓練（如實 驗一） ，並依其第三天 test 時的表現平均分配為三組（naïve、sham 與 lesion） ，分別接受不同的手術。Sham 與 lesion 組斑馬魚於乎術完畢 後休息五日，與 naïve 組一同進入 T 字形迷宮進行 retest，以瞭解手 術對於動物運動功能及以保存之空間記憶提取與表現的影響。三組斑 馬魚於手術前後皆接受自發性探索行為測試，以排除手術對動物運動 功能造成的可能影響。並於行為測試結束後以灌流方式取出動物腦 部，觀察手術破壞程度，各組手術方式如下： Group one：naïve 組 實驗控制組，不作任何手術。 Group two：sham 組 偽手術組，僅打開端腦上方頭蓋骨並重新黏合，但保持端腦之完整。 Group three：lesion 組 雙側端腦破壞組，打開端腦上方頭蓋骨，並以手術破壞雙側端腦，並 重新黏合頭蓋骨。. 32.
(34) 實驗三之手術與行為實驗之流程圖：. L 1day. A. T1 1hr. T2 1day. L: Locomotor activity A: Acclimation. Test 1day. L 1day 1day. S. L 5days. Retest. 1day. S: Surgery T1: Trial 1 T2: Trial 2. B. 實驗結果說明： 1. 自發性探索行為（Locomotor activity monitoring） 比較各組實驗動物在手術前、後表現之總游動距離與速率， 經過 one way ANOVA 分析顯示組間 main effect 並沒有達到統計 上的顯著水準（圖六）。表示無論實際接受手術破壞與否，sham 與 lesion 組的自發性運動行為並沒有受到明顯的影響。顯示端腦 破壞手術或打開頭蓋骨的偽手術，並不會改變動物在自發性運動 行為上的表現。此結果可排除手術造成動物行為表現差異的可能 性。. 33.
(35) 2. T 字形迷宮空間訓練（Spatial learning of T-maze） 空間記憶學習結果（圖七）經過 two factor with one repeated ANOVA 分析顯示 trial 間有顯著差異(p<0.001)，組內分析結果顯 示，經由 T 字形迷宮連續三天的訓練，naïve、sham 與 lesion 組 的斑馬魚在手術前皆能達到學習標準，建立保存空間相關之記 憶，其表現皆能在第三天達到顯著差異（p<0.01） 。顯示手術前各 組的空間記憶保存與表現能力皆無障礙。Retest 代表術後休息五 日，各組重回 T 字形迷宮時在空間記憶上的提取表現。此時 naïve 與 sham 組的表現與八天前 trial 1 時的表現仍有顯著差異（後設 檢定 naive 組 retest 與 trial 1 相比較，p<0.01；sham 組 retest 與 trail 1 相比較，p<0.01） ，顯示先前成功建立之空間記憶能夠被斑馬魚 所保存，且形成長期記憶，並在多日後被重新喚回表現。然而， lesion 組的表現與 trial 1 時的表現卻無顯著差異，顯示破壞對已 保存的空間記憶在提取表現上造成影響。這樣的結果支持實驗一 與實驗二的結果，證實斑馬魚具有空間相關之長期記憶，此外， 偽手術並不影響此形式的空間記憶習得、保存與提取表現。而 lesion 組相較於其他兩組在已保存之空間記憶提取與表現過程 中，產生了顯著的障礙。. 34.
(36) 實驗四、 探討空間訓練後進行單側端腦破壞對手術，對已建立保存之空間 記憶提取與表現影響。 A. 實驗說明： 本實驗使用 22 隻斑馬魚，透過 T 字形迷宮進行空間訓練，依其 第三天 test 時的表現平均分配為三組 （sham、left side lesion 與 right side lesion） ，分別接受不同的手術。Left side lesion 與 right side lesion 組 斑馬魚術完畢休息五日後，與 sham 組一同進行重測(retest)，以瞭解 手術對於動物運動功能，及對已保存之空間記憶提取與表現的影響。 並在 retest 後進行連續三天的 retrain，探討若以建立之空間記憶受影 響後，僅存半側端腦之斑馬魚，是否能夠再次接受空間訓練重新習得 空間記憶。三組斑馬魚於手術前後皆接受自發性探索行為測試，排除 手術對動物運動功能造成影響。並於行為測試結束後以灌流方式取出 動物腦部，以觀察手術破壞程度，各組手術方式如下： Group one：sham 組 偽手術組，僅打開端腦上方頭蓋骨並重新黏合，但保持端腦之完整。 Group two：left side lesion 組 左側端腦破壞組，打開端腦上方頭蓋骨，並以手術破壞左側端腦，並 重新黏合頭蓋骨。. 35.
(37) Group three：right side lesion 組 右側端腦破壞組，打開端腦上方頭蓋骨，並以手術破壞右側端腦，並 重新黏合頭蓋骨。 手術與行為實驗之流程圖：. L 1day. A. T1 1hr. T2 1day. L: Locomotor activity A: Acclimation T1: Trial 1 T2: Trial 2. Test 1day. L 1day 1day. S. L 5days. 1day. Retest 1day. ReT1 1day. ReT2 1day. S: Surgery ReT1: Retrain 1 ReT2: Retrain 2 ReT3: Retrain 3. B. 實驗結果說明： 1. 自發性探索行為（Locomotor activity monitoring） 比較各組實驗動物在手術前、後表現之總游行距離與速率， 經過 one way ANOVA 分析顯示組間 main effect 並沒有達到統計 上的顯著水準（圖八）。表示無論實際接受手術破壞與否，偽手 術對照（sham）、左側破壞（left）與右側破壞（right）組的自發 性運動行為並沒有受到明顯的影響。顯示端腦破壞手術或打開頭 蓋骨的偽手術，並不會改變動物在自發性運動行為上的表現。此 結果可作為排除手術造成動物行為表現差異的可能性，對於往後 連續的 T 字形迷宮空間訓練相當重要。. 36. ReT3.
(38) 2. T 字形迷宮空間訓練（Spatial learning of T-maze） 空間記憶學習結果（圖九）經過 two factor with one repeated ANOVA 分 析 顯 示 組 間 main effect 在 統 計 上 達 到 顯 著 差 異 (p<0.01)，組內分析結果顯示，經由 T 字形迷宮連續三天的訓練， 偽手術對照（sham）、左側破壞（left）與右側破壞（right）組斑 馬魚在手術前皆能達到學習標準，建立保存空間相關之記憶，其 第三天表現皆與第一天表現達到顯著差異（p<0.002），代表手術 前各組的空間記憶保存與表現能力皆無障礙。 Retest 結果為手術後休息五日，各組重回 T 字形迷宮，以測 試各組在空間記憶上的保存、提取與表現而作。此時 sham 與 right 組的表現與八天前 trial 1 在組內統計上仍有顯著差異（後設檢定 sham 組 retest 與 trial 1 相比較，p<0.02；right 組 retest 與 trial 1 相比較，p<0.002），顯示先前的學習水準仍可維持，且已建立之 空間記憶能夠被斑馬魚所保存與喚回表現，而 left 組這的表現與 trial 1 並無顯著差異。這樣的結果說明偽手術與右側端腦破壞並 不會損害此形式的空間記憶保存與提取表現，但左側端腦破壞卻 造成影響。顯示左側端腦破壞（left）組相較於其他兩組在已保存 之空間記憶提取與表現過程中，產生了顯著的障礙. 37.
(39) 最後 retrain 的結果經由組內分析結果顯示，sham 與 right 組 繼續保持相同水平的空間記憶表現，而 left 組在 retrain 期間抵達 目的地所花費時間逐次下降，達統計上顯著差異（p<0.002），甚 至在最後一次 retrain 3 表現與 sham 及 right 組在後設檢定上沒有 差異，顯示左側端腦破壞斑馬魚，似乎能夠利用仍存在的右側端 腦接受再次的空間訓練，達到空間學習的效果。. 38.
(40) 實驗五、 根據實驗四的結果，探討空間訓練前進行右側端腦破壞，是否對 斑馬魚空間記憶習得過程中造成影響。 A.實驗說明： 由實驗四結果初步得知，左側端腦破壞對斑馬魚已保存之空間記 憶提取與表現過造成影響，且右側端腦破壞斑馬魚不受影響。本實驗 將使用 16 隻斑馬魚，依自發性運動行為測試平均分為偽手術對造 （sham）組與右側破壞（right）二組，分別接受不同的手術，於手術 後進行 T 字形迷宮的空間記憶訓練，以瞭解手術對於動物運動功能及 空間記憶習得過程的影響。方式將如實驗一，術受休息五日後進行連 續三天的空間訓練，第三天為 test，目的在於測試並瞭解特定半球端 腦破壞是否亦影響斑馬魚空間記憶習得過程。二組斑馬魚於手術前後 皆接受自發性探索行為測試，排除手術對動物運動功能造成影響。並 於行為測試結束後以灌流方式取出動物腦部，以觀察手術破壞程度， 各組手術方式如下： Group one：sham 組 偽手術組，僅打開端腦上方頭蓋骨並重新黏合，但保持端腦之完整。 Group two：right 組 右側端腦破壞組，打開端腦上方頭蓋骨，並以手術破壞右側端腦，並 重新黏合頭蓋骨。 39.
(41) 實驗五之手術與行為實驗之流程圖：. S. L 1 day. A. L 5 days. L: Locomotor activity A: Acclimation T1: Trial 1 T2: Trial 2. 1 day. T1 1 hr. T2 1 day. Test 1 day. S: Surgery. B.實驗結果說明： 1.自發性探索行為（Locomotor activity monitoring） 比較各組實驗動物在手術前、後表現之總游行距離與速率， 經過 one way ANOVA 分析顯示組間 main effect 沒有達到統計上 的顯著水準（圖十）。表示接受手術後，偽手術對照（sham）與 右側破壞（right-lesion）組的自發性運動行為並沒有受到明顯的 差異。顯示端腦破壞手術不會造成運動功能障礙，打開頭蓋骨的 偽手術亦不會改變動物在自發性運動行為上的表現。此結果可作 為排除手術造成動物行為表現差異的可能性，對於往後連續的 T 字形迷宮空間訓練相當重要。. 40.
(42) 2.T 字形迷宮空間訓練（Spatial learning of T-maze） 空間記憶學習預期結果（圖十一）經由 two factor with one repeated ANOVA 分析顯示 trial 間有顯著差異(p<0.001)，組內分析 結果顯示，經由 T 字形迷宮連續三天的訓練，sham 組第三天的 表現與第一天相較達到顯著差異（後設檢定 sham 組 test 與 trial 1 相比較 p<0.05）。顯示斑馬魚透過訓練，能夠在三天內成功建立 空間記憶保存並表現。而 right-lesion 組在空間記憶的習得過程 中，雖於三次 trial 中花費時間逐次下降，似乎有學習的能力，故 在實驗設計上略作調整，額外在多作一次 trial（即 test 2），但其 四次 trial 的表現在統計上並無達到顯著差異，表示右側端腦破壞 可能使動物在空間學習上產生障礙，影響其空間記憶的保存或表 現。. 41.
(43) 陸、實驗討論（Discussion） 魚類與其他陸地脊椎動物相同，需要空間學習策略在環境中生 存。過去的研究發現，硬骨魚端腦同源於哺乳類海馬迴(Eichenbaum, Dudchenko, Wood, Shapiro, & Tanila, 1999; Hartley, Maguire, Spiers, & Burgess, 2003)在空間學習的建立上的地位舉足輕重。由於硬骨魚端腦 背側於腦部發育時期與哺乳類海馬迴源自胚胎神經管相同的細胞群 中，因此該腦區被認為具有相似於哺乳類的能力(Northcutt, 1981; Rodriguez, et al., 2002; Vargas, Rodr inverted question markiguez, JC, Arias, & Salas, 2000)。海馬迴在空間記憶上的角色無論是在哺乳類 (Hartley, Maguire, Spiers, & Burgess, 2003)、爬蟲類(Lopez, Broglio, Rodriguez, Thinus-Blanc, & Salas, 2000)及鳥類(Bingman, 1998)上皆已 被證實，而硬骨魚類同源於海馬迴的構造為端腦，前人曾利用金魚為 實驗模式證明出具有高度相似的空間定位功能。本研究以學習前與學 習後的端腦破壞手法，配合行為訓練，剖析斑馬魚端腦在空間記憶習 得、保存、提取與表現上的所能展現的能力。本研究結果將分為以下 三大部分討論：. A.全端腦破壞造成空間記憶習得（acquisition）之障礙 為了研究硬骨魚在空間學習上的表現能力，有許多實驗利用不同 類型的訓練模式來觀察研究斑馬魚在空間學習能力上的表現，例如 42.
(44) Saito 等人在 2004 年發展出改良自 Morris 的水迷宮，並放置魚餌作為 金魚在空間學習時的學習誘因(Saito & Watanabe, 2004)。當時為探討 空間記憶是否保存（retention）於金魚端腦，故在空間訓練後進行手 術，並且在術後 retrain，證實端腦破壞影響金魚已保存之空間記憶。 2006 年，Saito 等人又以金魚為模式，在空間訓練前進行手術，進而 瞭解端腦破壞亦影響空間記憶的習得（acquisition）(Saito & Watanabe, 2006)。在本實驗中則以斑馬魚喜愛深水區域作為學習誘因來訓練其 習得空間相關記憶，並以手術破壞模式來建立端腦破壞之斑馬魚，探 討斑馬魚端腦腦區是否參與空間記憶形成過程。各組接受空間訓練 前，皆以自發性探索行為測試排除手術對斑馬魚運動功能上的影響 （圖一、三、六、八） 。 實驗一所呈現的結果顯示，naïve 與 sham 組的斑馬魚經過連續空 間學習訓練後，在第三天的測試（test）時皆能表現出顯著的學習成 效，而 lesion 組斑馬魚在連續三天的表現並未有顯著差異（圖二）。 而組織灌流後各組腦部圖片比較（圖五）也顯示，lesion 組端腦相較 於 naïve 與 sham 組有明顯的手術破壞痕跡。這樣的結果，不但證實 了斑馬魚具有空間學習的能力，亦與過去以金魚為研究的實驗相同， 顯示端腦為斑馬魚空間記憶上不可或缺的腦區，被破壞後將在空間學 習與表現造成缺失(Lopez, Broglio, Rodriguez, Thinus-Blanc, & Salas,. 43.
(45) 2000; Portavella, Torres, Salas, & Papini, 2004; Portavella, Vargas, Torres, & Salas, 2002; Rodriguez, et al., 2002; Saito & Watanabe, 2004)。由此實 驗結果明顯證實，斑馬魚與同為硬骨魚類的金魚相同，需要端腦參與 執行空間相關記憶形成過程，亦支持演化過程中，硬骨魚類具有類似 於哺乳類之空間學習能力。 以人類著名的臨床個案為例，H.M.經過手術切除雙側顳葉內側 （包括海馬迴）後，造成了嚴重的順向失憶症(anterograde amnesia)， 無法將新學習的事物轉化為長期記憶，但卻保有完整的短期記憶能力 (Corkin, 2002)。一直到今天，他仍在每天學習新的事物，重新認識新 的朋友，因他喪失了將陳述型記憶轉化為長期記憶的能力。過去的硬 骨魚空間實驗中，大多以同一天數次 trials，連續訓練 3 至 6 天的方 式 ， 所 能 觀 察 到 的 為 空 間 性 長 期 記 憶 (Lopez, Broglio, Rodriguez, Thinus-Blanc, & Salas, 2000; Lopez, 1999; Saito & Watanabe, 2006)，欠 缺對短期記憶的觀察。 本研究的實驗一結果，與人類病患三臨床研究結果相符合，切除 端腦的斑馬魚無法將屬於陳述性記憶一類的空間性記憶轉化為長期 記憶，並在實驗一的結果獲得初步證實，動物在連續三天的訓練中表 現出學習障礙。並首次針對空間性短期記憶在實驗二中作進一步研 究。以同一天連續三次 trial，每次間隔一小時的方式進行測試。實驗. 44.
(46) 結果呈現，lesion 組無法如 sham 組斑馬魚在短時間內展現立即地空 間學習與記憶（圖四），這樣的結果顯示斑馬魚端腦，可能對空間性 短期記憶扮演了重要的角色。 B.已保存（retention）之空間記憶在端腦破壞後無法正常提取及表現 過去實驗發現，選擇性破壞大鼠海馬迴後的結果主要影響空間記 憶的習得而非保存(Jarrard, 1995)。另外鳥類研究也發現，破壞鴿子的 海馬迴僅損傷其空間習得能力，但不影響術前已保存的記憶，所以鴿 子仍舊能夠由釋放處返抵原先的飼養處(Bingman, Ioale, Casini, & Bagnoli, 1990)。這些研究顯示鳥類與哺乳類的海馬迴在空間學習的習 得過程扮演重要角色。然而被認為同源於陸地脊椎動物之海馬迴的硬 骨魚端腦，究竟如何在於空間性的學習與記憶中扮演何種角色？ Salas 等人於 1996 年以金魚為研究對象，在訓練後採用傳統手術 破壞法發展端腦剔除之金魚，結果發現此破壞使其在空間相關的記憶 表現上出現缺失(Salas, Rodriguez, Vargas, Duran, & Torres, 1996)，金 魚失去了原本學會的空間記憶，但是先前若為線索（cue）訓練出的 空間記憶尚能保存(Rodriguez, et al., 2002)。但以線索訓練得到的空間 記憶為利用反應性策略（response strategy），將迷宮或路線中出現的 視覺等相關線索作為導航依據以抵達目的地。而我們所探討的為位置 性策略（place strategy） ，利用應地應時習得目的地與獎賞之間的關連. 45.
(47) 性(Alves, Chichery, Boal, & Dickel, 2007)所形成的導航型空間記憶。 因此上述實驗結果指出，破壞金魚端腦確實影響動物以位置性策略習 得並保存的空間記憶。 實驗三的結果呈現出，原本 lesion 組在空間訓練過程中的表現與 naïve 及 sham 組相同（圖七），接能夠在第三天 test 時達到統計上的 顯著差異（P < 0.01） ，顯示成功習得並保存空間記憶。然而在訓練後 接受端腦破壞的 lesion 組，卻明顯在 retest 時出現提取與表現障礙。 這樣的結果印證了上述金魚實驗，破壞端腦將損傷先前已習得並保存 之空間記憶在提取與表現過程中出現障礙。. C.左、右端腦在空間記憶形成功能上具有不對稱性 日常生活時，我們很難體會大腦兩側半球在功能上是否對稱。有 一個例子是多數人具有慣用手。1851 年，Broca 在臨床研究發現左半 球額葉受損導致病患言語障礙且無法言語，而右半球對應區域受損卻 不影響語言表現，顯示左半球大腦兩半球在功能上可能存在不對稱 性。腦側化的研究不僅只是在人類上發現像是大腦左半球具有語言優 勢之外，更在其他物種陸續證實出有關腦側化的研究(Miklosi & Andrew, 1999)。例如大鼠(Denenberg, 1984)與鳥類(Clayton & Krebs, 1994)的右側大腦具有地理定位的優勢性，而青蛙(Vallortigara, Rogers,. 46.
(48) Bisazza, Lippolis, & Robins, 1998)與硬骨魚類(Cantalupo, Bisazza, & Vallortigara, 1995)則具有視覺側化（visual lateralization）功能。而硬 骨魚中的斑馬魚亦為視覺側化研究代表，其實驗中指出斑馬魚能夠在 特定環境與情境時選擇優先使用左眼（left eye system, LES）或右眼 （right eye system, RES）系統， 以便做出適應生存之反應(Andrew, Tommasi, & Ford, 2000; Miklosi & Andrew, 1999)。該實驗採取特定刺 激僅出現於斑馬魚左或右側方式得以證明斑馬魚亦具有腦側化。而過 去臨床研究大腦兩半球功能對稱性或不對稱性的常用方法中常有，在 單側半球部分或全部受損（如中風或為了緩解癲癇而進行手術切除） 的情況下觀察病人的行為變化(Raboyeau, et al., 2008)。 本研究實驗四中，在空間訓練後採取半側端腦破壞手術方式，在 端腦半球功能上探討斑馬魚空間記憶的保存、提取與表現。其結果呈 現各組在術前習得空間記憶後，retest 時卻僅有左側破壞組產生提取 與表現障礙（圖九），而右側端腦破壞組與偽手術組並無顯著差異。 組織灌流後各組腦部圖片比較（圖十）也顯示，左側破壞（left）與 右側破壞（right）組端腦相較於偽手術對照（sham）組有明顯的手術 破壞痕跡。這樣的結果顯示空間性記憶在端腦半球存取上可能具有不 對稱性，造成左側破壞組原先保存之空間記憶在提取表現上受到損 害，而右側破壞組則不受影響。而 retrain 過程中，左側破壞組能夠以. 47.
(49) 僅存的右側端腦進行重新的空間學習與記憶，這是否代表右側端腦為 空間記憶習得所必須？為更深入探討端腦左、右半球是否具有空間學 習的優勢性，故在實驗五中採取學習前右側端腦破壞實驗作釐清。而 實驗五的結果顯示，雖然右側破壞組似乎仍存有學習傾向，但學習效 果並不如 sham 組班馬魚般，能夠達到顯著，表示右側端腦破壞造成 斑馬魚在空間習得過程產生障礙，而其表現出之學習傾向可能為右側 破壞後剩餘左側端腦代償的結果（圖十一）。此實驗結果使得右側端 腦在功能上可能具有的優勢性被初步證實，且說明了說明右側端腦可 能為空間學習與記憶所必須。. 本研究首次利用斑馬魚特定腦部手術破壞方式探討與哺乳類等 陸地脊椎動物海馬迴同源之端腦腦區，除了驗證過去在同為硬骨魚的 金魚實驗中所獲結果相似，端腦在空間記憶的習得、保存、提取與表 現上扮演重要的角色，更釐清端腦所擔負重要性在空間性記憶型態上 不僅只是影響長期記憶尚有短期記憶。此外，單側破壞的實驗結果更 開拓硬骨魚腦側化方面的研究方法。在現階段斑馬魚擁有完整基因庫 且基因轉植容易而成為熱門實驗動物之際，相信如此的實驗結果能夠 在發育初期之學習與記憶與神經生理學等相關探索上，提供更廣泛的 研究層面。. 48.
(50) 柒、參考文獻（References） Adolf, B., Chapouton, P., Lam, C.S., Topp, S., Tannhauser, B., Strahle, U., Gotz, M., & Bally-Cuif, L. (2006). Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol, 295, 278-293. Alberini, C.M., Milekic, M.H., & Tronel, S. (2006). Mechanisms of memory stabilization and de-stabilization. Cell Mol Life Sci, 63, 999-1008. Alves, C., Chichery, R., Boal, J.G., & Dickel, L. (2007). Orientation in the cuttlefish Sepia officinalis: response versus place learning. Anim Cogn, 10, 29-36. Andrade, C., Alwarshetty, M., Sudha, S., & Suresh Chandra, J. (2001). Effect of innate direction bias on T-maze learning in rats: implications for research. J Neurosci Methods, 110, 31-35. Andrew, R.J., Tommasi, L., & Ford, N. (2000). Motor control by vision and the evolution of cerebral lateralization. Brain Lang, 73, 220-235. Bingman, V.P., Ioale, P., Casini, G., & Bagnoli, P. (1990). The avian hippocampus: evidence for a role in the development of the homing pigeon navigational map. Behav Neurosci, 104, 906-911. Bingman, V.P., Rithers, L.V., Strasser, R., Galiardo, A. (1998). The Neuroethology of avian navigation. In R.P. Bala, Pepperberg, I.M., Kamil, A.C. (Ed.), animal cognition in nature (pp. 201-206). New York: Academic Press. Broglio, C., Gomez, A., Duran, E., Ocana, F.M., Jimenez-Moya, F., Rodriguez, F., & Salas, C. (2005). Hallmarks of a common forebrain vertebrate plan: specialized pallial areas for spatial, temporal and emotional memory in actinopterygian fish. Brain Res Bull, 66, 277-281. 49.
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