補充chrysin對肌力運動表現的影響及其運動禁藥之評估

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

▉ 成 果 報 告

□期中進度報告

補充chrysin對肌力運動表現的影響及其運動禁藥δ

C‰評估

The effects of chrysin supplementation on strength performances and the

evaluation of its doping by δ

C‰

一、中文摘要 本研究目的在探討補充市售單方芳香族 酶抑制劑chrysin 是否會影響尿液中 T/E 比值及 δ13C‰。本實驗利用氣相層析質譜 儀(GC-MS)檢測 T/E 比值與同位素比值質 譜儀(IRMS)檢測 δ13C‰，並建立一套國際 認證的檢驗方法。第一部分的實驗中，氣 相層析儀使用的管柱為DB-5MS，樣品前 處理經液相萃取並使用MSTFA 衍生化， 在服用chrysin 後尿液中表睪固酮的濃度 為9.7-28.63 ng/mL，而睪固酮的濃度則低 於最低偵測極限(10 ng/mL)，所以無法計 算T/E 值。在第二部分的實驗中，氣相層 析儀使用的管柱為DB-17，樣品前處理經 固相萃取並使用醋酸酐與pyridine 進行乙 醯化反應，得到5β -pregnane-3α,20α-diol、etiocholanolone 與 androsterone 之 δ13C‰平均數值分別為 -24.25‰、-26.44‰及-25.25‰。5α -androstane-3α,17β-diol 和 5β -androstane-3α,17β-diol 則低於偵測極 限。在第三部分實驗中，短期服用高劑量 chrysin(3 g)並經 GC-MS 與 GC-IRMS 分 析，發現結果與第一及第二部份實驗結果 雷同。本實驗結果發現服用chrysin 並不違 反世界反運動禁藥組織之規範，至於是否 影響體內睪固酮的濃度，目前仍未清楚。 關鍵字：chrysin、睪固酮/表睪固酮值、同 位素比值質譜儀、δ13C

The purpose of this study was to investigate whether chrysin supplementation would affect urine T/E ratio and δ13C‰. We performed an international accredited method to detect T/E ratio and δ13C‰ by GC/MS (Gas chromatography-mass spectrometry) and IRMS (Isotope Ratio Mass Spectrometry), respectively. In study one; gas chromatography was equipped with a DB-5MS column. Sample was prepared by

liquid-liquid extraction and derivatized with MSTFA. After chrysin administration, the concentration of epitestosterone in urine was 9.7-28.63 ng/mL, but the concentration of testosterone was lower than detection limit (0.5ng/mL). In study two, gas

chromatography was equipped with a DB-17 column. Sample was prepared by solid phase extraction and derivatized with acetic anhydride and pyridine. The δ13C‰ values of 5β-pregnane-3α,20α-diol,

etiocholanolone and androsterone were -23.47‰, -24.19‰ and -24.76‰, respectively. The δ13C‰ value of 5α -androstane-3α,17β-diol and 5β

-androstane-3α,17β-diol were lower than detection limit. In study three, urines from chrysin supplementation (3 g/day) for 3 days were analyzed by GC-MS and GC-IRMS. The result showed that chrysin

administration does not violate the

prohibited list by WADA, but it is not clear that whether affects the concentration of testosterone in body.

K ey Word: chrysin, T/E ratio, Is ot ope r at io m ass

spectrometry, δ13_C

二、計畫緣由

運動員濫用同化性類固醇

chrysin (劉雄、高建德，2007)。過去關 於補充 chrysin 的研究相當少數，皆是 以補充複方為主，並沒有補充單方 chrysin 的研究，因此使用市售單方 chrysin 增補劑是否有違反運動禁藥規 範之疑慮，為本研究要釐清的問題。 世界反運動禁藥組織 (World

Anti-Doping Agency; WADA)於2009年所 頒布的細則中提到，若T/E值超過4，則可 以利用同位素比值質譜儀(Isotope Ratio Mass Spectrometry; IRMS)進行外源性或 內生性的確認。因此，本研究將探討補充 chrysin對運動禁藥δ13C‰ 之影響。 三、研究目的 本研究建立適合之GC-MS及 GC-IRMS的方法，藉以分析尿液中chrysin 之含量及δ13C‰之數值。 四、研究方法 本研究分為三個部分： 第一部分：利用GC-MS 測定服用 chrysin 後尿液中睪固酮與表睪固酮的比率。 （一）儀器設備與條件 以 GC-MS 為分析儀器工具，建立一 精密且準確之分析方法，以定量雞睪丸中 睪固酮之濃度。經過分析方法的尋找及確 效之後，其分析條件如下：使用儀器為 Agilent technologies HP7890A gas

chromatograph 結合 5975C mass selective detector。使用管柱為 DB-5MS capillary column (0.25 mm×15 m, 0.25 um)，升溫條 件為初始溫度120℃停留時間 2 分鐘，以 15℃/min 升溫至 230℃，再以 5℃/min 升 溫至250℃，停留時間 2 分鐘。注射口溫 度為250℃，氣體流速 1 ml/min，偵測模 式為selection ion monitor (SIM)，睪固酮與

3 hr ND ND ND 6 hr ND ND ND 9 hr ND ND ND 12 hr ND 9.7 ND 2 day ND 11.22 ND 2.5 day ND ND ND 3 day ND 12.45 ND 7 day ND ND ND 14 day ND 16.32 ND 21 day ND 28.63 ND 28 day ND ND ND *睪固酮偵測極限為 10 ng/mL *表睪固酮偵測極限為 2 ng/mL *ND:低於偵測極限 第二部分 建立適合之氣相層析同位素比 值質譜儀(GC/IRMS)之分析方法，以測定 δ13C‰之數值。 本部份實驗採用氣相層析同位素比值 質譜儀(GC-IRMS)分析尿液中 δ13C‰之數 值。分析之項目為睪固酮的前驅物5β -pregnane-3α,20α-diol(5βP)及睪固酮的 代謝物androsterone(Andro)、5α -androstane-3α,17β-diol(5αA)、 etiocholanolone(Etio)、5β-androstane-3 α,17β-diol(5βA)，藉由比較睪固酮之前 驅物與代謝物δ13C‰的數值，判斷是否為 陽性檢體。本實驗前處理步驟會有兩段沖 提液，第一段沖提液可觀察到5αA、5β A、Etio、Andro，第二段沖提液可觀察到 5βP、5αA、5βA。圖一為標準品於兩段 沖提液之質譜圖。圖二為服用chrysin 後尿 液於兩段沖提液之質譜圖。表二為服用 chrysin 後不同時間點體內 5BP、5AA、 5BA、Andro、Etio 其 δ13C‰值之變化情 形，5βP 平均值為-24.48‰，Etio 平均值 為-25.26‰，Andro 平均值為-25.25‰。其 中5αA 與 5βA 因低於偵測極限，以至於 無法獲得δ13C‰數值。 圖一、標準品IRMS 質譜圖。第一段沖提 液(A)及第二段沖提液(B)。 圖二、尿液檢體IRMS 質譜圖。第一段沖 提液(A)及第二段沖提液(B)。 表二、服用chrysin 後不同時間點體內 5BP、5AA、5BA、Andro、Etio 其 δ13C‰ 值之變化情形

3 day -24.55 ND ND -25.72 -25.71 7 day -24.58 ND ND -25.61 -25.22 14 day -24.52 ND ND -25.35 -25.16 21 day -23.76 ND ND -25.39 -24.96 28 day -24.20 ND ND -24.80 -23.65 第三部分 利用適合之氣相層析同位素比 值質譜儀(GC/IRMS)之分析方法，以測定 服用高劑量chrysin 後 δ13C‰之數值。 本部分採用 GC-MS 分析方法藉以測 定尿液中睪固酮與表睪固酮之比率，並利 用氣相層析同位素比值質譜儀(GC/IRMS) 分析尿液中δ13C‰之數值。表三呈現服用 高劑量chrysin 後不同時間點體內睪固 酮、表睪固酮與T/E 值之變化情形，與第 一部分一樣未能偵測到睪固酮的濃度，而 表睪固酮則在第空白點出現最高濃度為 41.7 ng/mL。表四呈現服用高劑量 chrysin 後不同時間點體內5BP、5AA、5BA、 Andro、Etio 其 δ13C‰值之變化情形，5β P 平均值為-24.25‰，Etio 平均值為 -26.44‰，Andro 平均值為-24.81‰。其中 5αA 與 5βA 因低於偵測極限，以至於無 法獲得δ13C‰數值。 表三呈現服用高劑量chrysin 後不同時間 點體內睪固酮、表睪固酮與T/E 值之變化 情形 時間點 睪固酮 表睪固酮 T/E 值 pre ND 41.7 ND 0.5 hr ND 3.13 ND 1 hr ND 12 ND 1.5 hr ND 9.59 ND 2 hr ND 8.3 ND 2.5 hr ND 9.31 ND 3 hr ND 8.63 ND 表四、服用高劑量chrysin 後不同時間點體 內5BP、5AA、5BA、Andro、Etio 其 δ13C‰ 值之變化情形

5βA 濃度低於偵測極限，所以無法比較結 果。由表二與表四的結果，經由計算5β P-Etio 與 5βP-Andro 的數值小於 3‰，且 Etio、Andro 之 δ13C‰大於-28‰，除了長 期服用chrysin 後第 1 小時 Etio 為 -28.88‰，但此時間點 Andro 的數值也略 為下降，爾後的時間點其δ13C‰數值又恢 復為-23‰ ~ -25‰，推測與儀器的誤差有 關，需進一步提升技術的穩定。長期或短 期高劑量服用chrysin 後並不會影響睪固 酮之類緣物成陽性反應。根據過去的研 究，男性尿液中Andro、Etio、5αA 及 5 βA 的量分別為 2.4-6.65 mg/24hr, 2.18-5.24 mg/24hr, 0.048-0.093 mg/24hr, 0.137-0.218 mg/24hr (Rose, 1969; Muller, 1987)，由此可看出 Andro、Etio 尿液中的 量遠大於5αA 及 5βA 的量，因此使用相 同之前處理方法對於5αA 及 5βA 的分析 仍有改善之空間。 七、結論與建議 本實驗採用 GC-MS 與 GC-IRMS 分 析尿液中T/E 比與 5βP、5αA、5βA、 Etio、Andro 之 δ13C‰，實驗結果發現長 期(1.5 g/day/28 day)或短期高劑量(3 g/day/3 day)服用 chrysin 後，並不造成尿液 中之T/E 值呈陽性反應，且 5βP、Etio、 Andro 之 δ13C‰也呈陰性反應，說明服用 chrysin 不會違反世界反禁藥組織(WADA) 之規定(2009)，但單方服用 chrysin 是否會 影響睪固酮的升成，由於睪固酮於尿液中 的濃度較低，未來建議檢驗血液檢體，並 檢測下視丘之相關激素，以更進一步了解 chrysin 對睪固酮之影響。 八、參考文獻 一､中文部分 1. 許美智、詹貴惠 (2005)：運動藥物 學。高雄：春橋田股份有限公司。 2. 劉雄、高建德 (2007)。黃岑研究進 展。甘肅中醫學院學報，24(2)，46-51 頁。 二､英文部分

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