【11】證書號數：I582106
【45】公告日： 中華民國 106 (2017) 年 05 月 11 日
【51】Int. Cl.： C07H21/04 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01)
發明 全 8 頁
【54】名 稱：用於鑑定蝴蝶蘭品種之粒線體微衛星之核酸序列區段及其鑑定方法及鑑定 套組
POLYMORPHIC MITOCHONDRIAL DNA MARKERS FOR DISTINGUISHING PHALAENOPSIS SPECIES AND THEIR IDENTIFICATION METHOD AND KIT
【21】申請案號：104119953 【22】申請日： 中華民國 104 (2015) 年 06 月 22 日
【11】公開編號：201700493 【43】公開日期： 中華民國 106 (2017) 年 01 月 01 日
【72】發 明 人： 張清俊 (TW) CHANG, CHING CHUN；林伯彥 (TW) LIN, BO YEN
【71】申 請 人： 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG UNIVERSITY
臺南市東區大學路 1 號
【74】代 理 人： 桂齊恆；林景郁
【56】參考文獻：
TW 201309804A1
劉育彰，台灣原生種姬蝴蝶蘭粒線體基因組的分析，國立成功大學生物科技研究所碩 博士班，碩士論文，2011 年
審查人員：曾信豪
【57】申請專利範圍
1. 一種用於鑑定蝴蝶蘭品種之粒線體微衛星之核酸序列區段，其係利用包含至少一引子對 經由聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)所合成；該至少一引子對係選自由 一第一引子對至一第二十五引子對所組成之群組且至少一引子對包含一正向引子以及一 反向引子，其中至少一引子對之各反向引子之 5’端所示序列與選自由該第一引子對至 該第二十五引子對所組成之群組之各反向引子之 5’端所示序列具有 50%至 100%一致性 之核苷酸序列；其中至少一引子對之各反向引子之 3’端所示序列與選自由與該第一引 子對至該第二十五引子對所組成之群組之各反向引子之 3’端序列具有 100%一致性之核 苷酸序列；其中該第一引子對包含如 SEQ ID NO：1 及 SEQ ID NO：2 所示序列之引 子；第二引子對包含如 SEQ ID NO：3 及 SEQ ID NO：4 所示序列之引子；第三引子對 包含如 SEQ ID NO：5 及 SEQ ID NO：6 所示序列之引子；第四引子對包含如 SEQ ID NO：7 及 SEQ ID NO：8 所示序列之引子；第五引子對包含如 SEQ ID NO：9 及 SEQ ID NO：10 所示序列之引子；第六引子對包含如 SEQ ID NO：11 及 SEQ ID NO：12 所示序 列之引子；第七引子對包含如 SEQ ID NO：13 及 SEQ ID NO：14 所示序列之引子；第 八引子對包含如 SEQ ID NO：15 及 SEQ ID NO：16 所示序列之引子；第九引子對包含 如 SEQ ID NO：17 及 SEQ ID NO：18 所示序列之引子；第十引子對包含如 SEQ ID NO：19 及 SEQ ID NO：20 所示序列之引子；第十一引子對包含如 SEQ ID NO：21 及 SEQ ID NO：22 所示序列之引子；第十二引子對包含如 SEQ ID NO：23 及 SEQ ID NO：24 所示序列之引子；第十三引子對包含如 SEQ ID NO：25 及 SEQ ID NO：26 所示 序列之引子；第十四引子對包含如 SEQ ID NO：27 及 SEQ ID NO：28 所示序列之引 子；第十五引子對包含如 SEQ ID NO：29 及 SEQ ID NO：30 所示序列之引子；第十六
引子對包含如 SEQ ID NO：31 及 SEQ ID NO：32 所示序列之引子；第十七引子對包含 如 SEQ ID NO：33 及 SEQ ID NO：34 所示序列之引子；第十八引子對包含如 SEQ ID NO：35 及 SEQ ID NO：36 所示序列之引子；第十九引子對包含如 SEQ ID NO：37 及 SEQ ID NO：38 所示序列之引子；第二十引子對包含如 SEQ ID NO：39 及 SEQ ID NO：40 所示序列之引子；第二十一引子對包含如 SEQ ID NO：41 及 SEQ ID NO：42 所 示序列之引子；第二十二引子對包含如 SEQ ID NO：43 及 SEQ ID NO：44 所示序列之 引子；第二十三引子對包含如 SEQ ID NO：45 及 SEQ ID NO：46 所示序列之引子；第 二十四引子對包含如 SEQ ID NO：47 及 SEQ ID NO：48 所示序列之引子；第二十五引 子對包含如 SEQ ID NO：49 及 SEQ ID NO：50 所示序列之引子。
2. 如請求項 1 所述之核酸序列區段，其中至少一引子對之各反向引子之 3’端所示序列與 選自由與該第一引子對至該第二十五引子對所組成之群組之各反向引子之 3’端序列中 至少 13 個連續序列具有 100%一致性之核苷酸序列。
3. 如請求項 1 所述之核酸序列區段，其中至少一引子對係選自由第一引子對至第十三引子 對所組成之群組。
4. 如請求項 1 所述之核酸序列區段，其中至少一引子對係選自由第二引子對、第三引子 對、第六引子對、第九引子對以及第十二引子對所組成之群組。
5. 如請求項 1 所述之核酸序列區段，其中至少一引子對係選自由第二引子對、第三引子 對、第九引子對以及第十二引子對所組成之群組。
6. 如請求項 1 所述之核酸序列區段，其中至少一引子對係選自由第二引子對、第三引子對 以及第十二引子對所組成之群組。
7. 如請求項 1 所述之核酸序列區段，其中至少一引子對係第三引子對。
8. 如請求項 1 所述之核酸序列區段，其中至少一引子對係選自由第十四引子對至第十七引 子對所組成之群組。
9. 如請求項 1 所述之核酸序列區段，其中至少一引子對係選自由第十八引子對至第二十五 引子對所組成之群組。
10. 一種用於鑑定蝴蝶蘭品種之粒線體微衛星之引子對，其包含至少一如請求項 1 至 9 任一 項所述之第一引子對至第二十五引子對。其中至少一引子對之各反向引子之 5’端所示 序列與選自由該第一引子對至該第二十五引子對所組成之群組之各反向引子之 5’端所 示序列具有 50%至 100%一致性之核苷酸序列；其中至少一引子對之各反向引子之 3’端 所示序列與選自由與該第一引子對至該第二十五引子對所組成之群組之各反向引子之 3’端序列具有 100%一致性之核苷酸序列。
11. 如請求項 10 所述之引子對，其中至少一引子對係選自由第一引子對至第十三引子對所組 成之群組。
12. 如請求項 10 所述之引子對，其中至少一引子對係選自由第二引子對、第三引子對、第六 引子對、第九引子對以及第十二引子對所組成之群組。
13. 如請求項 10 所述之引子對，其中至少一引子對係選自由第二引子對、第三引子對、第九 引子對以及第十二引子對所組成之群組。
14. 如請求項 10 所述之引子對，其中至少一引子對係選自由第二引子對、第三引子對以及第 十二引子對所組成之群組。
15. 如請求項 10 所述之引子對，其中至少一引子對係第三引子對。
16. 如請求項 10 所述之引子對，其中至少一引子對係選自由第十四引子對至第十七引子對所 組成之群組。
17. 如請求項 10 所述之引子對，其中至少一引子對係選自由第十八引子對至第二十五引子對 所組成之群組。
18. 如請求項 10 至 17 任一項所述之引子對，其中至少一引子對之各反向引子之 3’端所示 序列與選自由與該第一引子對至該第二十五引子對所組成之群組之各反向引子之 3’端 序列中至少 13 個連續序列具有 100%一致性之核苷酸序列。
19. 一種蝴蝶蘭品種之鑑定方法，其包括下列步驟：提供一待鑑定之蝴蝶蘭組織樣品，並萃 取該蝴蝶蘭組織樣品之基因體 DNA；利用包含一如請求項 10 至 18 任一項所述之至少一 引子對與基因體 DNA 進行聚合酶連鎖反應，以取得該蝴蝶蘭組織樣品之粒線體微衛星 之核酸序列區段之序列長度或序列變異程度；將該蝴蝶蘭組織樣品之核酸序列區段之序 列長度或序列變異程度與一已知之蝴蝶蘭基因型資料庫進行比對，以鑑定該蝴蝶蘭品種。
20. 一種蝴蝶蘭品種之鑑定套組，其包括如請求項 10 至 18 任一項所述之粒線體微衛星之引 子對。
圖式簡單說明
圖 1A 係本發明之第一引子對至第六引子對分別針對 15 種蝴蝶蘭原生種進行多型性程度 分析之電泳分析圖。其中，M 表示 DNA 標誌；1 至 11 依序表示 P.equestris、P.aphrodite、
P.schileriana、P.stuartiana、P.sanderiana、P.lueddemanniana、P.amboinensis、
P.pulcherrima、P.fasciata、P.venosa、P.gigantea、P.mannii、P.javanica、P.parishii、
P.amabilis 等 15 種蝴蝶蘭原生種。
圖 1B 係本發明之第七引子對至第十三引子對分別針對 15 種蝴蝶蘭原生種進行多型性程 度分析之電泳分析圖。其中，M 表示 DNA 標誌；1 至 11 依序表示 P.equestris、P.aphrodite、
P.schileriana、P.stuartiana、P.sanderiana、P.lueddemanniana、P.amboinensis、
P.pulcherrima、P.fasciata、P.venosa、P.gigantea、P.mannii、P.javanica、P.parishii、
P.amabilis 等 15 種蝴蝶蘭原生種。
圖 2 係本發明之第二引子對、第三引子對、第六引子對、第九引子對及第十二引子對分 別針對 19 種蝴蝶蘭原生種進行多型性程度分析之電泳分析圖。其中，M 表示 DNA 標誌；1 至 19 依序表示 P.equestris、P.aphrodite、P.schileriana、P.stuartiana、P.sanderiana、
P.lueddemanniana、P.amboinensis、P.pulcherrima、P.fasciata、P.venosa、P.gigantea、
P.mannii、P.javanica、P.parishii、P.amabilis、P.bellina、P.fuscata、P.pulchra、P.violacea 等 19 種蝴蝶蘭原生種。
圖 3 係本發明之第二引子對、第三引子對、第九引子對及第十二引子對分別針對 11 種姬 蝴蝶蘭栽培種進行多型性程度分析之電泳分析圖。其中，M 表示 DNA 標誌；1 至 11 依序表 示 P.equestris、P.equestris var.alba、P.equestris var.coerulea、P.equestris f.aurea、P.equestris var.leucaspis、P.equestris-deep red flower、P.equestris-white flower、P.equestris-white flower with yellow lip、P.equestris-white flower with blue lip、P.equestris-peloric mutant、P.equestris- ball shaped flower 等 11 種姬蝴蝶蘭栽培種。
圖 4 係本發明之利用第二引子對、第三引子對及第十二引子對所擴增之三組粒線體微衛 星之 DNA，經聚類分析 11 種姬蝴蝶蘭栽培種之演化樹。
圖 5 係本發明之第十五引子對分別針對 11 種姬蝴蝶蘭栽培種所擴增之粒線體微衛星之 DNA 之多重排比圖。其中，1 至 11 依序表示 P.equestris、P.equestris var.alba、P.equestris var.coerulea、P.equestris f.aurea、P.equestris var.leucaspis、P.equestris-deep red flower、
P.equestris-white flower、P.equestris-white flower with yellow lip、P.equestris-white flower with blue lip、P.equestris-peloric mutant、P.equestris-ball shaped flower 等 11 種姬蝴蝶蘭栽培種。
