中華民國第 51 屆中小學科學展覽會 作品說明書
科別：生物科 組別：高中組
作品名稱：給我一個『素』解法
—colicin 1b 對牲畜害菌之抑致能力 關鍵詞：colicin 1b、蛋白純化、抑菌圈
編號：
摘要
本實驗主要是希望能利用細菌植株所產生的大腸桿菌素之一：colicin1b（大腸桿菌素 colicin 能抑制並殺死與自己親緣相近的大腸桿菌），來抑制會對家畜例如牛、羊和豬造成疾病 並導致家畜幼體死亡率提高的病菌。我們先分離並製備好 colicin 1b，再分別添加在實際從染 病或因牲畜傳染病而死的牛、羊、豬中體內所分離出 15 株的有害菌株，並培養觀察 colicin 1b 對這些菌株的作用，最終我們測試得知 colicin 1b 對其中 7 株害菌的確達到抑制效果，未來或 許可以發展成生物製劑來取代傳統施用抗生素方式，以降低抗藥性細菌的產生來減低畜牧業 經濟損失。
壹、研究動機：
在一次的校外教學到豬舍的參觀中，我們看到了許許多多的成豬，但卻沒有看到幼豬，
我們詢問了飼主，才得知養豬戶通常會將成豬與幼豬分開飼養；因為出生不到兩星期的小豬 經常因大腸桿菌的影響，造成嚴重的腹瀉而引起營養吸收不良，進而使小豬的死亡率提高，
因此引起我們對大腸桿菌的興趣，於是我們在查詢資料時從一篇國外論文中（Dietary Inclusion of Colicin E1 Is Effective in Preventing Postweaning Diarrhea Caused by F18-Positive
Escherichia coli
in Pigs，2007）得知有些大腸桿菌會產生大腸桿菌素colicin，來抑制與自己親緣相關的菌種，於 是我們更進一步的去找尋資料時，得知中興大學分生所實驗室有相似的大腸桿菌菌株，可以 產生一種大腸桿菌素：colicin 1b，這種大腸桿菌素的分泌，可能會造成其動物體內體內之菌 相的改變，因此，我們想說是否可以利用這個特性來抑制小豬體內的有害菌叢。近幾十年來，隨著台灣人口的增長，對肉品的需求量也大幅提高，但是台灣地狹人稠，
因此集約式的高密度養殖方式也就成了考量成本後的必要措施，然而，這種高密度養殖方式 不僅因清理不易而造成牲畜身上的病原菌增加，有時甚至還會造成牲口的大量死亡。多數飼 主為了預防或抵禦這些病菌，常常施加各種大量的抗生素，雖然效果短時間內收效甚著，但 長久下來卻也使得病菌衍生出抗藥性，而使得牲口疾病的治療更加棘手，另一方面，若人類 攝取含高量抗生素的肉品後，也可能導致人體腸胃道健康菌相的失衡。
有鑑於此，我們由中興大學獸醫系取得了由牛豬羊等牲畜體表和體內分離出的 15 株致病 菌，並添加從菌株中萃取出的細菌素 colicin 1b，觀測其對於此 15 株菌的抑制效果，如果 colicin 1b 真能抑制這些病菌，或許未來可以發展取代現行施用抗生素的措施，而達到降低日趨嚴重 的「超級細菌」問題。
貳、研究目的
一、測試大腸桿菌產出細菌素之濃度。
二、測試大腸桿菌產出細菌素之活性。
三、測試 PBS 是否會對 colicin 1b 造成影響。
四、colicin 1b 對牲畜腸內 15 株害菌的抑制效果。
參、研究設備及器材
一、實驗菌種：
PGE80-col1b/pAcyc184-imm DH5α 表一：實驗測試菌種
NO.2 台中乳牛糞 NO.4 善化牛體表 ADDC 豬腸溶血 E-coli
ADDC 禽類卵黃 囊
ADDC 禽類肝臟 ADDC 豬肺溶血 E-coli
NO.14 善化牛體 表
W910 L4a 101008 C4b 101910 S4c 101008 S4d 101008 S2b 101008 S4b 101008 M1b 101008 M1a
二、實驗藥品：
Lysis buffer、Elution buffer#1~#5（NaH2PO4 50Mm、NaCl 300Mm、Imidazol 50mM~300Mm）、Tris EGTA buffer、BSA、PSA、HiTrap Q sepharose 樹脂、血清瓶、攪拌台。
三、實驗設備和器材：
冷房、SDS 電泳用具、微量吸管(100µl~1000µl、20µl~200µl、0.2µl~20µl)、eppendorf、
（一）、生物安全操作台 （二）、高速離心機
圖一 圖二
（三）、-80℃冰箱 （四）、光譜儀
圖三 圖四
（五）、大型震盪機 （六）、大型高速離心機
圖五 圖六
（七）、高壓滅菌機 （八）、大型 37℃培養箱
圖七 圖八
‧
‧ （九）、pH meter （十）、French press 機
圖九 圖十
肆、研究過程方法
一、流程圖：
二、步驟說明：
（一）、製備大量大腸桿菌
‧ 37∘C，over night
LB argar 和 LB broth 配置時 都須先加入 Ap 和 Cm 兩種 抗生素以去除雜菌。
‧ 37∘C，over night
負控制組為跑 SDS 電泳 時的對照組。
IPTG 使抑制物無法結合到 操作因子上，讓操作因子大 量表現 col1b 蛋白。
當作接下來 SDS 電泳的樣 本，錐形瓶內的為控制組。
（二）、濃縮菌液和 SDS page 蛋白電泳：
（三）、French press 破菌：
（四）、純化
Elution buffer 依照濃度，從低 濃度到高濃度，每 1ml 分裝，
共 36 管。
（五）、透析：
（六）、ELISA reader
（七）製作含菌培養基和測試抑制力：
37∘C，over night
37∘C，over night
室溫靜置 15min，，待其冷卻凝 固。
colicin 1b 依照 1/2、1/4、1/8、1/16、
1/32、1/64 的倍率稀釋。
伍、研究結果
一、利用 SDS page 檢視控制和負控制組蛋白表現：
二、
對照組
Marker
實驗組
圖十一
圖十一、培養液中加入 IPTG 作為誘導劑，加強 Promoter 的啟動促使 protein 大量表現。利用 SDS page 檢視控制組（實驗組）是否真的有產生比負控制組（對照組）還大量的 colicin 1b。
根據圖十一的電泳結果顯示，控制組產生的 colicin 1b 明顯比負控制組還要多，且跟標準 Marker 比較，產生的蛋白量有達到進行下一階段純化的價值。
二、利用 SDS page 檢視純化效果及選取透析結果：
圖十二
選取高濃度蛋白進行透析
圖十三
選取高濃度蛋白進行透析
圖十二和圖十三、從純化出的 36 管中，每一個濃度的 Elution buffer 選取三管進行 SDS page 檢 視純化效果以及選取接下來透析的 colicin 1b。
從圖十二和圖十三的電泳結果顯示，colicin 1b 集中在 Elution buffer#1 和#2，從這當中我們挑 出了 5 管進行透析。而從純化效果來看，電泳顯示雜 band 和圖一比較明顯少了許多，證明純 化有達到一定的效果。
三、利用 SDS page 檢視透析後 colicin 1b 依然存在：
確定依然存在
圖十四
圖十四、因為我們用 PBS 透析，PBS 是培養細胞的培養液，不確定 PBS 是否會對
colicin 1b 造成傷害，導致蛋白的破壞，所以從透析完的液體當中吸取一些進行 SDS page，證 明 colicin 1b 存在是否
從圖十四的結果顯示，colicin 1b 依然存在，並沒有被 PBS 破壞。
四、測試蛋白活性：
圖十五
圖十五、同第四點的原因，不知到是否會對 colicin 1b 造成傷害進而使其失去活性，所以用含 DH5α的培養基測試蛋白活性。
從圖十五的結果顯示，稀釋倍率從 1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 都有抑菌圈出現，代表其活 性依然存在沒有被破壞。
五、計算蛋白濃度
表二、利用 PSA 做為標準曲線，用 ELISA reader 在測出 colicin 1b OD595 的數值，計算出蛋白 的濃度。
1
16 倍稀釋 0.4224
1/16
1/8
1/32
1/4
1/2
從表二曲線和 16 被的 OD 值，將 OD 值代入方程式之中的 X 計算出 y 值，就是我們稀釋 1/16 倍的蛋白濃度，再回乘濃度約為 0.124µl/ml。
六、抑菌效果（Ｏ為有反應，Ｘ為無反應）
表三，測試 colicin 1b 對 15 株致病菌的抑制效果。
從實驗結果顯示，15 株致病菌當中有 7 株有效果，而這 7 株當中又有 3 株為強抗藥性細菌。
表四，測試 PBS 培養液是否對這 7 株在表二有效果的致病菌造成傷害。如果 PBS 造成傷害，
代表表二的實驗是有問題的。
根據實驗結果顯示，PBS 對這 7 株致病菌皆無造成傷害，證明表二實驗效果的確是由 colicin 1b 造成的。
表五、研究抑制效果的實驗中，每一個濃度都三重複測試，計實驗三重複的結果（指數為重 複達效果的數目）。
稀釋倍率 /菌名
NO.2 台中 乳牛 糞
NO.4 善化牛 體表
ADDC 豬肺溶 血 E-coli
NO.14 MDR 善化牛 體表
101008 C4b
101008 S4d
101008 M1a
1/2 O3 O3 O3 O3 O3 O3 O3 1/4 O3 O3 O3 O3 O3 O3 O3 1/8 O3 O3 O3 O3 O3 O3 O3 1/16 O3 O3 O3 O3 O3 O3 O3 1/32 O3 O3 O3 O3 O3 O3 O3 1/64 O3 O3 O3 O3 O3 O3 O3
根據統計結果，三重複都出現了抑制效力。
陸、討論
從上述的結論與結果中可以得知，我們嘗試的 15 株致病菌株，有 7 株有抑制效果，相較
於抗生素的累積性，以及此致病菌對抗生素的強烈抗藥性，
colicin 1b 可說是目前針對這些頑強致病菌較好的抑制方式，，雖然這些致病菌尚未完全確定 其特性，可是當我們證實其的確能對這 7 株致病菌產生抑制作用，不僅一方面防止其和其他 細菌發生接合生殖，杜絕致病的質體 DNA 再次被轉移到另一種細菌，而產生更難纏的病原 體，也利用了比人工合成的外來抗生素較為生物性的方法來抑制此致病菌的生長。我們希望 未來能依照各生物體內的環境量產，製造出口服膠囊、針劑等，實際應用於幼小豬仔上，提 高幼小豬仔的存活率，此不但能取代易累積於牲畜體內，且不易被牲畜分解的抗生素，降低 我們食用時間接吸收到的抗生素，更可以協助不同牲畜抵禦抗藥性強烈的病原體，減少病原 體產生抗藥性突變的機會！
而我們從另一篇論文（Human Tumor Cells Are Selectively Inhibited by Colicins）得知 colicin 也可以對癌細胞產生抑制效果，但文章所提之 colicin 為 colicin E1，未來也可以將 colicin 1b 測 試於癌細胞的抑制，研究是否也能有相同的功效。
柒、結論：
一、大量製備 colicin1b：
(一)首先我們希望能取得足夠的 colicin 1b 來進行實驗，因此我們以異丙基-β-D-硫代半乳糖 苷(IPTG)來促進系菌操縱組的表現，達到產生大量 colicin 1b 的效果。而為了確認 IPTG 的作用
效果，我們設計兩組菌株並加以培養；一組有加 IPTG(實驗組)和另一組沒有加 IPTG(對照組) 。 (二)培養後取小量進行蛋白質電泳分析，確認蛋白質表現量是否有增加；由圖十一比較兩者 SDS-PAGE 電泳膠片差異，便可驗證 IPTG 確實能促使菌株產生大量 colicin 1b。
(三)確認完 IPTG 的有效後，即可利用 French Press 機的超音波來震碎大量培養液中菌株 DH5 α的細胞膜，來達成分離蛋白質和菌株的效果。
二、純化到透析：
(一)從電泳膠片看來，圖十二、十三的雜 Band 比圖一明顯少了許多，且 colicin 1b 集中在 Elution buffer#1 和#2，顯示 colicin 1b 在低濃度 Elution buffer 就被沖出來，這樣大幅降低 colicin 1b 在高濃度鹽類中受到傷害的因素，最後我們選取其中五管進行透析。
(二)透析及電泳膠片結果
我們將選取好的蛋白溶液集中，將蛋白從鹽度較高的 Elution buffer 移至 PBS 溶液中，並於透 析完畢後，抽出一些樣本進行電泳，進而確定 PBS 不會傷害到
colicin 1b 活性或破壞 colicin 1b。
(三)從純化 60ml 到透析約剩 5ml。
三、測試抑制效力：
(一)15 株致病菌有 8 株為強抗藥性病菌，這八株菌株皆為從腸道分離出之菌種。測試結果 裡，有效 7 株含有 3 株強抗藥性病菌。
(二)PBS 對這 15 株致病菌也不起作用，代表實驗結果不會因 PBS 而造成影響。
(三)在三重複的實驗數據也顯示，在稀釋倍率為 1/64 就有肉眼可見的成效，約 0.032µl/ml 濃度的 colicin 1b 就有一定的抑制效果，當然稀釋倍率越少，抑菌效果越顯著。
四、分析結果
(一)15 株牲畜致病菌為我們從中興獸醫系取得，幾乎都是未命名的菌株，所以相關致病菌 株的背景資料相對較少。但這些從牛糞、牛體表、豬肺和牲畜腸道中分離的菌，我們看到了 colicin 1b 對其致病菌的抑制效果。
捌、參考資料和其他：
一、ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY（2007）Dietary Inclusion of Colicin E1 Is Effective in Preventing Postweaning Diarrhea Caused by F18-Positive
Escherichia coli
in Pigs二、Lorna E. Lancaster，Wolfgang Wintermeyer，Marina V. Rodnina（2006）Colicins and their potential in cancer treatment
三、J. CHUMCHALOVÁ, J. MARDA（2002）Human Tumor Cells Are Selectively Inhibited by Colicins
四、郭鴻志，陳保基，魏恒巍，張紹光（2009）氯四環黴素與枯草菌素對大腸桿菌與糞腸 球菌抗菌劑感受性與表現之影響。
五、洪嘉伶（無日期）大腸桿菌中大腸桿菌素 colicin Ib 之分泌。
