第六章 enzyme

(1)

第六章酵素



除了少數具催化活性的

RNA 酵素

「稱核糖

_酶

_{(Ribozyme) 」外，}

酵素幾乎全是蛋白質。



生命過程是由無數的生化反應組成

，沒有酵素催化這些反應，即無法

維持生命的運作。

(2)

溶解酵素空間填充模式　溶解酵素 (lysozyme) ，是發 現於眼淚和唾液的酵素，靠著水解細胞壁的多醣而摧毀某些細菌。在這個空間填充模式中，顯示多胜肽和 一個接合的多醣 ( 綠色 ) 片段在一起。

(3)

圖

_{6-1 受質與酵素在活性部}

位結合。

(4)

 A + B C 

溫度升高或增加反應物濃度

時 A 與 B

兩種分子碰撞的機會增加，但並不是

所有的碰撞皆能導致化學反應，當碰

撞分子擁有促成一個化學反應發生的

最少能量

_{(activation energy:}

稱活化能 ) 時，反應發生。

(5)

(6)



在生物體，升高反應溫度會破壞生

物結構而且細胞內的反應物濃度物

低，因此要加速生化反應，生物體

選擇酵素

_{(enzyme) 來克服面臨的}

問題。

(7)

酵素具有數種特性



1 酵素的催化能力強



2 催化具高度的特異性，副產品

鮮少生成，與無機催化劑有顯著的

差異。



3 因為酵素結構複雜，酵素常具

有調控的功能。

(8)

酵素的作用



催化劑能增加化學反應的速率，但

本身的卻不變。其角色在降低化學

反應的活化能，換句話催化劑能供

反應走低活化能的途徑。

(9)

過渡狀態

_(transition

state)

 發生在兩個反應途徑的高峰處。生物反應時，過渡狀態發生在受質結合酵素時。蛋白催化劑提供特殊的表面與反應物結合，一些酵素修正它們結構形狀，進而降低活化能且形成受質 _{(substrate) 的過渡狀態。}  酵素能穩定過渡狀態，如此有利於反應的進行，但酵素不能改變反應的平衡，但可加速達到平衡狀態。

(10)

圖

_{6-5(a)(b) 假想一個折棒}

酵素（

_{stickase ）催}

化金

屬棒之斷裂。

(11)

圖

_{6-5(c) 假想一個折棒酵}

素（

_{stickase ）催化}

金屬棒之斷

裂。

(12)

 酵素分子皆含有獨特且複雜的結合表面稱活化位置 _{(active site) ，反應} 物分子稱 _{(substrate) ，能結合酵素} 的活化位置。這些活化位置常位於大蛋白質分子結構中的一個小的裂縫 (cleft) 或罅隙 (crevice) 。  活化位置並不一定是結合位置，有許多胺基酸的 R 基會排在活化置參與催化的過程。

(13)

 一些酵素的催化活性是依靠活化位置上的胺基酸與受質間的交互作。  一些酵素需要結合非蛋白質部分才具有活性。這些酵素的輔因子 _(cofactor) 可能是離子 ( 如 Mg2+ 、 Zn2+) 或複雜的有機分子，如輔酶等。這些酵素的蛋白質內不含輔因子稱 _{apoenzyme ，帶} 上輔因子的酵素，稱 _{holoenzyme 。}

(14)

酵素的分類

 世界生化聯合會 (IUB) 建立了一套命名酵素的系統。分 (E.C.A.X.X.X.), 其中 EC _{是 enzyme} commission ，而 A 的部分有六種主要的項目  1 Oxidoreductase: 氧化還原酶催化氧化還原反應。  2 Transferase: 轉移酶催化轉移一個分子上的基 _{(group) 至另一個分子上面。}  3 Hydrolase: 水解酶催化鍵的斷裂，伴隨水的加入。包含酯化酶、去磷酸酶、 _peptidase 。

(15)

 4 lyase: 溶解酶催化除去分子中的 (H2O 、 CO2 與 NH3) 形成雙鍵或加入這些基 (H2O 、 _CO₂ 與 NH₃_{) 至雙鍵上。如 decarboxylase} 、 hydratase 與 deaminase 。  5 Isomerase: 異位酶催化數種型式的分子 (intramolecular rearrangement) Epimerases 催化不對稱碳的轉換。 Mutase 催化分子內的功能基的轉換。  6 Ligase: 接合酶催化兩個受質分子形成共價鍵。這些反應所需的能量常是 _{ATP 水解後供應。}

(16)

(17)

酵素動力學

_(Enzyme

Kinetics)

 當 A 為受質和 P 為產物時， A→ P 反應的初始速率 _v₀ 為：

(18)

 如果反應是 A + B P ，反應速率依兩個反應濃度而改變，即 A 與 B 必須碰撞才能形成產物者

(19)



Michaelis-Menten Kinetics



研究酵素催化速率最常用的模型是由

Leonor Michaelis

與 Maud

Menten

在 1913 年提出的 : 當受質

(substrate: S) 結合酵素於活化

位置時，會形成過渡狀態中間複合物

(ES) ，此時、受質被轉換成產物。

(20)

米契爾 -曼騰動力學

(21)

 它的假設是 (1) 和 k₃ 比較時 k_1;k₂ 是可以忽略； _{(2) 在絕大部分反應中 ES} 形成之速率要等於 _{ES 分解之速率 [ 後} 者符合所謂的穩定狀態假設。

(22)

米契爾 - 曼騰方程式推導

 k₁[E_f][S] = k₂[ES] + k₃[ES]  [E_t] = [E_f] + [ES]

 k₁([E_t]-[ES])[S] = (k₂+k₃)[ES]  [ES] = k₁[E_t][S] / k₁[S]+(k₂+k₃)  v = k₃[ES]

(23)

 Vmax = k₃[E_t]

 v = k₁{ k₃[E_t][S] / k₁[S]+(k₂+k₃) }  Vmax[S]

(24)

圖 6.4 在ㄧ個典型酵素催化反應

中，反應速率 V 和受質濃度

_[S]

(25)

酵素動力學的參數

 Vmax : 反應能達到的最大速率  k_M : 是一個常數，稱米氏常數 (Michaelis constant)  k_M 越小，酵素與受質的親和力越大。  k_M 越大，酵素與受質的親和力越小。

 轉換率 :Turnover number (kcat)

在每個酵素作用下，受質每秒轉換成產物數量的值。

(26)

 酵素之轉變數 (turnover number) (kcat) 被定義為

(27)

(28)

酵素活性的定量



酵素活性的量度是以國際單位

「 international unit (I.U.)

，一個

_{I.U. 的定義成每分鐘產生 1}

μmole 的產物。



專一活性

(Specific activity)

是用來表示酵素的純度的單位。定義

(29)

Lineweaver-Burk Plots



賴威弗 - 伯克圖

(Lineweaver-Burk Plots): 假如一個酵素遵

守 Michaelis-Meten

kinetics 模型 , 當受質濃度改變

時，經由初速的量取可以決定

_km

與 Vmax 值。

(30)

 Michaelis-Menten 方程式為  一種常用的轉換方式就是將 Michaelis-Menten 方程式兩邊同時做倒數處理。方程式成為：再將方程式右方的分子分開：再簡化成：  此形式的 Michaelis-Menten 方程式稱為 ineweaver-Burk 方程式（ Lineweaver-ineweaver-Burkequation ）。 p.209 BOX 6-1 Michaelis-Menten 方程式的轉換型式：雙倒數繪圖

(31)

p.209

(32)

賴威佛 -伯克圖解

(33)

(34)



1/[S] 為 X 軸， 1/[V]

為 Y 軸

，畫出其線性的圖形。



km/Vmax 是其斜率，直線與 X 軸

相交的點為

_{– 1/km}

，

Vmax

、 km 的值可由斜率與交會點

求出。

(35)

酵素的抑制

 酵素活性能被一些抑制劑所抑制，研究酵素抑制的機制具有實際的應用性。  1 臨床的治療應用  2 充當生化研究的工具。  抑制可能是  1 不可逆抑制  2 可逆抑制

(36)

 而不可逆的抑制劑通常會與酵素分子形成共價鍵，而形成共價鍵的胺基酸常位於活化位置。  例如一些以硫醇基 (-SH) 為活化位置的酵素，常受到 _{iodoacetate 所抑制。} _{Glyceraldehyde-3-phosphate} dehydrogenase (G3PD) 會與 iodoacetate 形成共價鍵，造成酵素失去活性。

(37)

 酵素抑制作用

(38)

Amoxicillin with clavulanic acid (Beta-lactamase inhibitor)

(39)

(40)

 青黴素的機轉 : 1. 競爭性抑制細菌酵素 transpeptidase 2. 能作用在細菌 Penicillin-binding proteins, 抑制細菌細胞壁的合成

(41)

NDM-1 superbugs



New Delhi

Metallo-beta-lactamase (NDM-1) is an

enzyme that makes bacteria

resistant to a broad range of

beta-lactam antibiotics

(42)

 The most common bacteria that

make this enzyme are Gram negative such as

Escherichia coli and Klebsiella

pneumoniae ( 肺炎克雷白氏菌 ), but

the gene for NDM-1 can spread from one strain of bacteria to another by horizontal gene transfer.

(43)

可逆性抑制

 當抑制劑能與酵素的結合是非共價鍵結合時，它們彼此是可分離的。  可逆性的抑制可分成 :  1 競爭性 (competitive) 的抑制  2 非競爭性 (noncompetitive) 的抑 制  3 不競爭性 (uncompetitive) 的抑 制

(44)

競爭性的抑制作用

 當抑制劑的結構與酵素專一性的受質結構很類似時，因為它的結構很相似，因此可競爭結合酵素的活化位置，形成酵素與抑制劑的複合體。  由於抑制劑會佔據活化位置，且無助於產物的生成，導致酵素的活性減少。  而競爭性的抑制劑抑制酵素活性可經由受質濃度之增加而逆轉。

(45)

(46)

圖 6.7 競爭型抑制反應的米

契爾 -曼騰圖

(47)

圖 6.11 酵素抑制反應的動力

分析

(a) 競爭型抑制反應。在 1/v 對 1/[S] 的圖中，存在不同濃 度的抑制劑相交於垂直軸相 同的 1/V_max 點上。

(48)

 因此當受質 (substrate) 的濃度很高時，所有受質的活化位置皆充滿受質，此時反應速率也可達到 _Vmax  例如 :  Succinate + FAD Furmarate + FADH2  此反應中相當出名的抑制劑 malonate ，是屬於競爭性抑制劑。

(49)

非競爭性抑制

 抑制劑結合酵素的位置不是活化位置時，會導致 _EI 與 EIS 的複合體的形式，此時抑制劑與酵素結合能改變酵素的三度空間的結構並抑制其反應。  例如  AMP 是一個 fructose-1,6-bisphosphatase 的非競爭性抑制劑，非競爭性的抑制並不會因增加受質的濃度而可逆。

(50)

非競爭型抑制劑

(non-competitiveinhibitors)

(51)

圖 6.10 非競爭型抑制反應的米

契爾 -曼騰圖

(52)

圖 6.11 酵素抑制反應的動力

分析

(c) 非競爭型抑制反應。在 1/v 對 1/[S] 的圖中，存在 不同濃度的抑制劑，皆相交於㈬平軸上的相同－ 1/K_m 點上。在非競爭型抑 制反應中 ES 和 EIS 的解 離常數倍假設維持相同。

(53)

不競爭抑制

 抑制劑只結合 ES( 酶與受質的複合物 ) ，而不結合非游離的酶。  加入更多的受質至反應中，結果增加反應之速率，但無法達到無抑制作用時之程度。  不競爭型抑制反應最常出現在酶結合不只一個受質之反應。

(54)

(55)

圖 6.11 酵素抑制反應的動力

分析

(b) 不競爭型抑制反應， 在 1/v 對 1/[S] 的圖中， 存在不同濃度的抑制劑，在垂直軸及水平軸皆無交於相同點上。

(56)

酵素抑制的動力學分析

 競爭性抑制與非競爭性的抑制很容易由雙倒數圖 _{(double-reciprocal plots)} 區別出來。  1 競爭性 (competitive) 的抑制  1/V=1/Vmax+k_M(1+I/Ki)/Vmax(1/ [S])

(57)

 2 非競爭性 (noncompetitive) 的抑 制

 1/V=1/V_max(1+I/K_i)

(58)

酵素催化時溫度與

_{pH 的效應}

 溫度 :  溫度越高，反應速率越高。這是因為更多的分子具有足夠的能量達到 transition state 。  酵素的反應速率會隨溫度增加，但因蛋白質在高溫會變性，因此每一個酵素皆有最大效能的溫度 _(optimum temperature) 。

(59)

圖 6.17 溫度對酵素活性之影

響

(60)

pH 值的影響

 氫離子濃度以數種方式影響酵素  1 氫離子的濃度影響活化位置上胺基酸的離子程度。  2 改變離子基的電荷可能影響酵素的三度空間的結構。 _{pH 值劇烈的改變，常} 導致酵素的變性。大部分的酵素僅能在窄小的 _{pH 範圍具有活性。}

(61)

圖 6.18 pH 值對兩個酵素之

影響

(62)

動力學的研究給與酵素催化生化反應的訊息相當少，一些技術常用於研究酵素催化的機制。如 _{x- 射線繞射的結晶} 學、化學修飾法與定點突變法等。  催化機制 :  雖然只有少數酵素機制被詳細的了解，但卻有普遍的共通性。

(63)

酵素催化的詳細機制

 以下是一個酵素的催化機制。

 1 Chymotrypsin: chymotrypsin 是一個 27

kDa 的蛋白質，屬於 serine protease 家族的

一員。所有 _{serine protease 的活化位置皆含}

一組特性的胺基酸 Ser 、 His 與 Asp 。

 以 chymotrypsin 與其受質類似物共結晶的研究

中顯示， _His57 、 Asp102 與 Ser195 這幾個胺

基酸是位於彼此接近的活化位置上。而活化位置上的 serine 對於這族蛋白的催化活性機制至為重要。

(64)

 酵素催化作用的詳細機制

胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin)

(65)

圖

6 .1

9 胰

凝

乳

蛋

酶

作

用

可

能

的

機

制

(66)

圖 6.20 酒精去氫酶活化沒位置

的官能基群

(67)

酵素的調控

 在活細胞中的酵素催化反應常呈現連續步驟型的代謝途徑。每一個途徑是由一系列的催化步驟組成。生物體已進化明智的機制來調控代謝途徑。調控必需的理由如下 :  1 維持細胞的秩序 : 調控每一個途徑，產生維持細胞結構與功能的物質且不致於浪費資源。  2 保存能量 : 當省則省，當用則用。  3 應付環境的變化 : 細胞能依照環境的所需，增加或減少其反應速率。

(68)

酵素催化中輔因子的角色

 數種因素有助於酵素的催化。  1 金屬離子 : 生命體內重要的金屬分成兩類 _{(1) 過渡金屬離子 (Fe}2+ 與 Cu2+)  (2) 鹼土族 :Ca Mg  過渡金屬最適合輔助催化反應，而鹼性金屬雖然在生物體中扮演重要的角色，但罕出現在輔助酵素功能上。

(69)

輔酶

_(Coenzyme)

 Vitamine 此字源於波蘭生化學家 Casimir Funk 。在 1912 年，他從米殼中純化出一種微量的有機營養物，此種物質可阻止一種營養缺乏症 _{Beriberi (“ 腳氣病} ”一種神經退化症 ) 。因為這個因子 (factor) 具胺類 (amine) 特性，因此稱此因子為 _{vitamine; 意思是這個胺類物質} 是生命必需的。之後、其他微量且必需的有機營養物陸陸續續被發現，因為並非都是胺類，因此把尾字的 e 去掉成為 _{vitamin 。}

(70)

Nicotinamide

 Vitamin are essential component of

coenzymes and enzyme prosthetic groups

 Nicotinamide is the active group of the

coenzymes NAD+ and NADP+

 Nicotinamide 具有兩個相同的

coenzymes(NAD+ 與 NADP+) 。這些

coenzymes 在生物體中具有氧化態 NAD+

(71)

圖 6.15 菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸

(72)

圖 6.15 菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸 b

(73)

 Biochemical functions

 Otto Warburg 首先純化出

glucose-6-phosphate dehydrogenase 之後証實

NADP+是其 Coenzyme

 The nicotinamide component of these

coenzymes serves as the transient

intermediate carrier of a hydride ion (H- ) that is enzymatically removed from

a substrate molecule by the action of certain dehydrogenase.

(74)

Vitamin B

₂

(riboflavin)

 Vitamin B2 (riboflavin) is a

component of the flavin nucleotides

 Vitamin B2 或 riboflavin 首先是由牛奶

中分離出來， _{1935 年由 Paul Karer 証} 實其結構並合成出來。它具有深黃色是由於帶有 _{isoalloxazine ring system 。隨} 後再証實它具有兩形式的 _coenzyme;

flavin mononucleotide (FMN) _與

(75)

(76)

(77)

 Biochemical functions

 They function is tightly bound

prosthetic groups of a class of dehydrogenases known as

flavoproteins or flavin dehydrogenase.

 serves as a transient carrier of a pair

(78)

(79)

酵素的調控

 調控代謝途徑是相當複雜的，調控的模式具有四種方式 _:  1 基因控制 (genetic control)  2 共價鍵修飾 (covalent modification)  3 異化調控 (allosteric regulation)  4 區隔性 (compartmentation) 。

(80)

 1 基因控制 :  酵素的誘發 : 依據細胞代謝的需要而合成酵素，能允許細胞對環境的改變作有效的反應。  例如 : 大腸桿菌生長在葡萄糖的環境，當培養基加入乳糖時，一開始並無法代謝乳糖。當培養基中缺乏葡萄糖時，大腸桿菌開始利用乳糖，乳糖相關的酵素合成被啟動。

(81)

 2 共價修飾 :  一些會經由形成可逆性的活化型與失活型酵素來調控其活性。數種酵素的共價修飾形式會改變酵素的三度空間的結構並改變其活性。肝醣磷酸化酶 _(glycogen phosphorylase) 是催化肝醣分解的第一個化學反應。許多荷爾蒙的作用是透過磷酸化此酵素的 _{serine 的位置來活化。}

(82)

 數種酵素是以不活化的前驅物被產製與儲存，稱 _proenzyme 或 Zymogen 。 Zymogen 被轉換成活化的酵素，經由不可逆的斷裂一個或數個 _peptide bond 。例如 chymotrypsinogen 是由胰臟生成後分泌至小腸，隨後由數個步驟轉成活化形式。

(83)

圖 6.21 胰凝乳蛋白酶原的活化

作用

(84)

 異化調控 :

 細胞利用異化調控來有效的反應胞內狀況的改變。異化酵素常受到數種

effector 作用。結合 effector 至異化酵素能影響受質與酵素的結合。

(85)

圖 6.22 酵素催化反應之速率是

受受質濃度作用

(86)

圖

6 .2

3 回

饋

抑

制

作

用

(87)

(88)

區隔

_{(compartmentation)}



在真核細胞中，生化代謝途徑常由

不同的胞器區隔出來。這些生理上

的區隔使得某些剛好相反的途徑變

得很好控制。例如脂肪的合成發生

在胞質中，而脂肪的分解反應卻發

生在粒線體。另外一些因子在特定

的胞器內具有較高的濃度。

(89)

酵素的技術在醫學上的應用

 牛胃中得到的蛋白” rennin” 是一個

protease ，數千年來已用來產生起司 (cheese) 。

 酵素應用在醫學上是源於 1954 年，研究者

發現， aspartate aminotransferase (GOT) 在心肌梗塞 (myocardial infraction) 患者的血液中會升高。，接下來又發現肝臟損壞的病人，血液中 _{GPT 會升高。之後酵素技術常用} 於醫學的診斷與治療方面。

(90)

圖 6.A 一個心臟受損其血清心

臟酵素濃度的特性圖形

(91)

臨床上有兩種利用酵素的方式

 1 直接測量一些酵素的活性 : 例如診斷攝副腺癌，是偵測受測者血液中的 acid phosphatase 的活性。  2 利用酵素來偵測一些代謝物是否正常，如 urate oxidase 用來偵測血液中尿酸 (uric acid) 的濃度。這個代謝物在痛風 (gout) 患者的血液中常具高濃度。

(92)

治療用的酵素

 使用酵素充當醫學治療是相當侷限的，當酵素注入病人後，酵素常快速的分解或失活。而且大量的酵素打入常會引起過敏反應。但也有一些成功的例子 _{: 例如由鍵球菌生產的} 鍵球激酶 (Streptokinase) ， Streptokinase 是鍵球菌生長在組織內必需的 _{protease ，} 因為它能溶解血栓。因此常用來治療心肌梗塞患者，助其除去血管的栓塞。

第六章 enzyme

第六章 酵素

除了少數具催化活性的

RNA 酵素

「稱核糖

(Ribozyme) 」外，

酵素幾乎全是蛋白質。

生命過程是由無數的生化反應組成

，沒有酵素催化這些反應，即無法

維持生命的運作。

圖

6-1 受質與酵素在活性部

位結合。

溫度升高或增加反應物濃度

時 A 與 B

兩種分子碰撞的機會增加，但並不是

所有的碰撞皆能導致化學反應，當碰

撞分子擁有促成一個化學反應發生的

最少能量

(activation energy:

稱活化能 ) 時，反應發生。

在生物體，升高反應溫度會破壞生

物結構而且細胞內的反應物濃度物

低，因此要加速生化反應，生物體

選擇酵素

(enzyme) 來克服面臨的

問題。

酵素具有數種特性

1 酵素的催化能力強

2 催化具高度的特異性，副產品

鮮少生成，與無機催化劑有顯著的

差異。

3 因為酵素結構複雜，酵素常具

有調控的功能。

酵素的作用

催化劑能增加化學反應的速率，但

本身的卻不變。其角色在降低化學

反應的活化能，換句話催化劑能供

反應走低活化能的途徑。

過渡狀態

(transition

state)

圖

6-5(a)(b) 假想一個折棒

酵素（

stickase ）催

化金

屬棒之斷裂。

圖

6-5(c) 假想一個折棒酵

素（

stickase ）催化

金屬棒之斷

裂。

酵素的分類

酵素動力學

(Enzyme

Kinetics)

Michaelis-Menten Kinetics

研究酵素催化速率最常用的模型是由

Leonor Michaelis

與 Maud

Menten

在 1913 年提出的 : 當受質

(substrate: S) 結合酵素於活化

位置時，會形成過渡狀態中間複合物

(ES) ，此時、受質被轉換成產物。

米契爾 -曼騰動力學

米契爾 - 曼騰方程式推導

圖 6.4 在ㄧ個典型酵素催化反應

中，反應速率 V 和受質濃度

[S]

酵素動力學的參數

酵素活性的定量

酵素活性的量度是以國際單位

「 international unit (I.U.)

，一個

I.U. 的定義成每分鐘產生 1

μmole 的產物。

專一活性

第六章酵素

_{(Ribozyme) 」外，}

_{6-1 受質與酵素在活性部}

_{(activation energy:}

_{(enzyme) 來克服面臨的}

_(transition

_{6-5(a)(b) 假想一個折棒}

_{stickase ）催}

_{6-5(c) 假想一個折棒酵}

_{stickase ）催化}

_(Enzyme

_[S]

_{I.U. 的定義成每分鐘產生 1}

_km

_{– 1/km}

_{pH 的效應}